瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii)脂肪酸去饱和酶FAD2和延伸酶ELOVL5的克隆及表达分析

脂肪酸去饱和酶(FAD,fatty acyl desaturase)及延伸酶(ELOVL,elongases of very long chain fatty acids)在鱼类脂肪代谢过程中发挥了重要作用。利用RT-PCR克隆得到瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii)肝脏中控制高不饱和脂肪酸合成的(FAD2)和(ELOVL5)基因cDNA序列。瓦氏黄颡鱼FAD2cDNA片段长2041bp,编码447个氨基酸,含有3个组氨酸簇(HDx GH,Hxx HH,Qxx HH),含亚铁血红素结合基序(HPGG)的类似细胞色素b5结构域等。瓦氏黄颡鱼ELOVL5 cDNA片段长1065bp,编码294个氨基酸,含有组氨酸簇(Hxx HH)、内质网停留信号(K、R)和4个ELO共有的保守区域(Kxx Exx DT,Qxx FLHx YHH,Nxxx Hxx MYx YY,Txx Qxx Q)等结构域。荧光定量PCR分析表明,FAD2和ELOVL5 m RNA在瓦氏黄颡鱼脑、肝脏的表达量最高,显著高于肠道、脾脏、肾脏、鳃等组织。结果表明,瓦氏黄颡鱼具有合成高不饱和脂肪酸的关键酶FAD2和ELOVL5,且肝脏为合成高不饱和脂肪酸的主要场所。

Δ6-去饱和酶和C20-延伸酶抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的研究

为探讨外源基因Δ6-去饱和酶与C20-延伸酶基因对肿瘤细胞增殖的抑制作用,本研究选取了微拟球藻(Nannochloropsis oculata)作为研究对象,对其Δ6-去饱和酶与C20-延伸酶基因进行了逆转录PCR扩增,并将获得的上述2个基因的编码区与真核表达质粒pEGFP-C3构建重组表达质粒,转染乳腺癌细胞MCF-7,以pEGFP-C3为对照,培养48h后,在荧光显微镜下观察转染细胞中的GFP荧光信号以判断重组质粒表达情况,荧光实时定量PCR分析转染细胞中外源基因的转录水平,MTT比色法检测外源基因对MCF-7细胞的增殖抑制程度,高效气相色谱检测转染细胞中多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的含量变化。结果表明2个外源基因均可在MCF-7细胞中表达,并能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,改变MCF-7细胞中2种PUFAs的相对含量,且n-3PUFAs与n-6PUFAs的比值升高。推测过表达的Δ6-去饱和酶与C20-延伸酶可能通过改变乳腺癌细胞MCF-7细胞膜中PUFAs的相对含量,达到抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的效果。

超长链脂肪酸延伸酶家族的功能及表达调控

超长链脂肪酸延伸酶(elongase of verylong chain fatty acids,ELOVL)家族是哺乳动物中一类编码超长链脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFA)延伸酶的基因家族。该家族有7个成员:ELOVL1～7。各个成员编码的蛋白质参与不同长度脂肪酸链的延长,对脂肪酸的代谢进行调控,进而发挥其生物学功能。本文就该家族成员的结构、生物学功能及表达调控进行综述。

超长链脂肪酸延伸酶6在原发性痛风患者外周血单个核细胞的异常表达及其临床意义

目的探讨超长链脂肪酸延伸酶6（ELOVL6）在原发性痛风性关节炎（GA）发病中的作用。方法274例GA患者根据临床表现分为GA急性期（AGA，158例），GA非急性期（NAGA，116例），实时荧光定量多聚合酶链反应（RT-qPCR）检测GA组和健康对照组（112名）PBMCsELOVL6基因转录水平；蛋白印迹法检测其蛋白表达水平；收集研究对象一般临床资料和实验室资料进行单因素分析和Pearson相关分析。结果PBMCsELOVL6转录水平在GA组（0．0016±0．0006）显著低于健康对照组（0．0026±0．0012）（P〈0．01），且AGA组（0．0013±0．0027）低于NAGA组（0．0020±0．0015）（P〈0．01）；GA组ELOVL6蛋白表达水平明显低于健康对照组（P〈0．01）。AGA组ELOVL6mRNA水平与ESR呈负相关（r=-0．416，P〈0．05）；GA组ELOVL6mRNA水平与白细胞总数呈负相关（r=-0．215，P〈0．05）；与TC、血清胰岛素等多项代谢相关指标呈正相关（r=0．38，0．187；P均〈0．05）。结论ELOVL6基因及蛋白在痛风患者PBMCs的异常表达提示其可能参与了痛风的发病，可能在痛风的炎症免疫及营养代谢障碍机制中均发挥了作用。

重叠延伸聚合酶链反应克隆大鼠Foxo3a基因及序列测定

目的获得大鼠Foxo3a基因全长编码区基因。方法运用重叠延伸PCR方法从大鼠脾脏总RNA中扩增Foxo3a编码区基因全长,将其插入pMD19-T载体中进行酶切及测序鉴定。结果Foxo3a编码区基因全长2019bp,与GenBank中大鼠Foxo3a基因同源性为99.9%。结论运用重叠延伸PCR技术可成功克隆高GC含量大鼠Foxo3a的cDNA,为进一步研究该基因奠定了基础。

应用固相聚合酶延伸反应的基因芯片检测技术

将 5’末端为氨基修饰的寡聚脱氧核糖核苷酸片段点样于硫氰基修饰的玻片表面 ,制备成 5’端氨基与玻片表面异硫氰基共价交联的寡核苷酸微阵列 ,并在相应目标序列存在的条件下进行聚合酶延伸反应。结果显示 :与目标序列配对的寡聚核苷酸可以延伸产生荧光信号 ;进一步的实验表明 ,寡核苷酸 3’末端碱基与目标序列不配对或误配时所产生的荧光信号还不及完全配对时所产生的荧光信号的 1 3,从而提供了另一种检测基因位点变异的技术。与现有的基因芯片检测技术相比 ,这种方法不仅结果可靠灵敏 ,而且简便快速、重复性好。

基于改进的重叠延伸聚合酶链式反应技术快速制备DNA分子质量标准

采用改进的重叠延伸聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,简便、快速地制备DNA分子质量标准。首先,利用普通PCR技术扩增5 和3 两端序列一致的DNA片段。随后,在重叠延伸PCR的变性和退火过程中,2个单链的3 端互补序列可形成双链,且这些单链片段可同时作为模板和引物,在PCR延伸过程中延长片段。随着反应循环数的增加,小片段产物逐渐减少,大片段产物逐渐增多。取不同循环数的重叠延伸PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,根据电泳结果选择最佳的PCR循环数或不同循环数的最佳组合,无须回收纯化,即可得到分子质量相差100bp的DNA分子质量标准。经琼脂糖凝胶电泳检测,所制备的DNA分子质量标准条带清晰、分子质量准确、条带均一性好,可用于标记DNA分子质量大小。总之,本研究用于DNA分子质量标准制备的方法操作简单,周期短,成本低,无副产物,且能够根据具体需求定制DNA分子质量标准的大小。

黄曲霉基因敲除体系的构建及其RNA依赖的RNA聚合酶1基因在生长发育中的作用

目的探讨黄曲霉(A.flavus)基因敲除体系的构建和RNA依赖的RNA聚合酶1(RDRP1)基因在A.flavus生长发育中的作用。方法通过National Center for Biotechnology Information网址查找RDRP1基因,设计上下游序列引物,引入融合片段20 bp,采用重叠PCR(overlap PCR)法融合RDRP1基因上下游片段和嘧啶磺胺抗性基因(ptrA);采用聚乙二醇(PEG)介导方法将该融合片段导入A.flavus的原生质体中获得RDRP1阳性转化子(ptrA抗性),采用Sourthern blot鉴定筛选RDRP1基因突变菌株;对RDRP1基因突变菌株,采用十字交叉法测定生长速率、血细胞计数板统计产孢量,手动计数Wickerham Medium(WKM)+尿嘧啶尿苷(UU)培养基上产生的菌核数量。结果获得ptrA抗性转化子13个;Sourthern blot鉴定4个为RDRP1基因缺失菌株,效率30.8%;与CA14相比,RDRP1基因突变菌株在表型、生长率、产孢量及菌核发育上差异无统计学意义(P>0.05)。结论overlap PCR结合PEG介导转化的方式可短时间内获得A.flavus基因敲除突变菌株,RDRP1基因不参与A.flavus表型、生长率、产孢量及菌核发育的调控作用。

重叠延伸PCR方法的建立与应用

目的建立一种新型PCR技术(重叠延伸PCR)并用于腺病毒早期基因E1A与内核蛋白体进入位点IRES(internalribosomeentrysite)的直接连接,为构建复制型腺病毒载体作准备。方法以PcAE1A质粒与PIRES-EGFP质粒为模板,通过引物设计,使E1A基因3’端与IRmES基因5’端具有相互重叠的一段序列,用该组引物行PCR分别扩增E1A基因与IRES基因,再以这两种PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸PCR扩增E1A-IRES基因片段。结果经酶切及测序鉴定重叠延伸PCR方法成功构建了E1A-IRES基因片段。结论重叠延伸PCR法能将任意两段DNA序列连接起来,其在分子生物学的领域中具有潜在应用价值。

重叠延伸PCR构建EB病毒BMRF1-BZLF1N融合基因

目的构建EB病毒BMRF1-BZLF1N融合基因,并分析其克隆表达。方法用重叠延伸PCR将EB病毒的BMRF1基因和BZLF1N基因通过多肽接头(Gly4Ser)2的DNA序列进行连接,构建BMRF1-BZLF1N融合基因,并进行核苷酸序列测定。结果 DNA序列分析结果表明,该融合基因BMRF1-Linker-BZLF1N的连接顺序、方向及序列完全正确。结论成功构建了EB病毒BMRF1-BZLF1N融合基因,为该融合基因克隆表达产物的应用研究提供了依据。

长足大竹象超长链脂肪酸延长酶家族的全基因组鉴定及其分子进化

超长链脂肪酸延伸酶(Elongation of very long chain fatty acids protein;ELO)是决定长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)脂肪酸生物合成的关键酶。利用生物信息学方法对长足大竹象ELO基因家族的基因结构特征及其编码蛋白序列进行详细的分析以期探究长足大竹象ELO基因家族调控其脂肪酸生物合成的分子机制。结果表明,从长足大竹象基因组序列中共鉴定出15个ELO基因家族成员,分别位于四条染色体上。其等电点9.22~9.68、呈碱性。该家族蛋白具有稳定性、疏水性、具有跨膜现象、且有多个磷酸化位点、二级结构以α-螺旋为主。Cbu ELO蛋白家族共鉴定出10个保守基序。通过构建Cbu ELO蛋白家族进化树分析,长足大竹象与赤拟谷盗的ELO蛋白家族亲缘关系最近。该研究结果为深入探索长足大竹象ELO基因的功能提供了参考依据。

利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术制备HLA-A＊ 0201/HBc18-27单链三分子复合体

目的：构建和表达HLA-A＊0201/HBc18-27单链三分子复合体。方法：利用重叠延伸PCR将HBc18-27、（Gly4Ser）3、β2m、（Gly4Ser）4和HLA-A＊0201胞外区依次串联为单链三聚体（single-chain trimer,SCT）融合基因,通过同源重组克隆技术插入到pET28a原核表达载体,用异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,采用金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白,通过稀释复性法折叠成HLA-A＊0201/HBc18-27的复合单体,并生物素化,将单体包被到直径4.5μm的磁性微球,用构象特异性单抗（W6/32）进行荧光染色,流式细胞术分析其空间构象。结果：pET28a-HLA-A＊0201/HBc18-27基因序列和蛋白大小与预测一致;纯化后融合蛋白纯度约93%;流式细胞术分析显示pET28a-HLA-A＊0201/HBc18-27单体具有正确的空间构象。结论：利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术成功制备了HLA-A＊0201/HBc18-27的单链复合体,无需限制性内切酶和连接酶,发展了主要组织相容性单链复合体技术,有效简化了pMHCⅠ类分子的制备过程。

大鼠细胞外信号调节激酶1基因3'非编码区双荧光素酶报告载体的构建及rno-miR-15b-5p对其活性的影响

目的以大鼠细胞外信号调节激酶1(ERK1)基因3'非编码区(UTR)为研究对象,构建含有ERK1基因3'UTR区的野生型以及突变型重组双荧光素酶报告载体,通过分析双荧光素酶报告载体的活性,明确rno-miR-15b-5p对报告载体的调节作用。方法采用miRNeasy Mini Kit提取大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞的总RNA,以PC12细胞的c DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)将ERK1基因3'UTR克隆到pmiR-RB-Report^(TM) vector中。利用重叠延伸PCR,将ERK1基因3'UTR中的rno-miR-15b-5p潜在的靶序列TGCTGCT分别突变成CGAACGT和GTACACG,并将突变的ERK1基因3'UTR克隆到pmiR-RB-Report^(TM) vector中。结果成功构建了包含ERK1基因3'UTR区的野生型报告载体pmiR-ERK1 3'UTR和突变型报告载体pmiR-ERK1-mut 3'UTR。利用荧光素酶活性检测系统,发现rno-miR-15b-5p mimic可以降低野生型报告载体的活性(P<0.001),但不影响突变型报告载体的活性。结论成功构建ERK1基因3'UTR区野生型和突变型双荧光素酶报告载体,初步证明ERK1基因3'UTR区是rno-miR-15b-5p的结合靶点。

干扰ELOVL6基因对奶牛乳腺上皮细胞脂代谢相关基因的表达及甘油三酯合成的影响

为揭示超长链脂肪酸延伸酶6(ELOVL6)对奶牛乳腺上皮细胞脂代谢及甘油三酯含量的影响,试验采用PCR技术扩增得到ELOVL6基因CDS区,利用在线软件对蛋白的疏水性和跨膜区进行预测,合成并筛选靶向ELOVL6基因的有效siRNA,将有效siRNA转染乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测干扰ELOVL6基因对奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢相关基因表达的影响,利用试剂盒检测细胞内甘油三酯含量。结果表明:(1)克隆得到全长为795 bp的奶牛ELOVL6基因(GenBank登录号:MW960011)的CDS区;经序列比对发现,奶牛的ELOVL6基因序列与牛(NM_001102155.1)、山羊(NM_001314257.1)、大羚羊(XM_040237469.1)的同源性分别为100%、96.73%、96.35%;ELOVL6蛋白的理论等电点为5.94,疏水最大值为2.467,最小值为-2.411,具有6个跨膜区域。(2)成功筛选到靶向ELOVL6基因的siRNA,干扰效率达到90%以上(P<0.05)。(3)将筛选出的siRNA转染至奶牛乳腺上皮细胞,通过qRT-PCR技术检测乳脂合成相关基因的表达,与对照组相比,干扰ELOVL6基因显著抑制了脂肪酸从头合成及去饱和相关基因乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBF1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、脂肪酸转运相关基因脂肪酸结合蛋白(FABP3)、甘油三酯合成相关基因二酰甘油酰基转移酶(DGAT1)、磷酸甘油酰基转移酶6(AGPAT6)和甘油三酯水解相关基因激素敏感性脂肪酶(HSL)的表达量(P<0.05)。(4)干扰ELOVL6基因后,乳腺细胞内的甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。上述表明,ELOVL6基因在奶牛乳腺上皮细胞中通过影响脂质代谢相关基因的表达及甘油三酯含量,进而对奶牛乳腺的脂代谢产生调控作用。

日本松干蚧不同虫态的泌蜡特点及FAS与FAE的含量变化

本文采用显微观察技术及酶含量测定方法,对日本松干蚧Matsucoccus matsumurae(Kuwana)分泌蜡质的几个虫态及各虫态虫体内与蜡质合成相关的脂肪酸合成酶(FAS)和脂肪酸延伸酶(FAE)的含量变化进行了研究。结果表明:雄性泌蜡主要在二龄若虫期和三龄若虫期,前者为珠形若虫,虫体分泌少量湿蜡,在体表形成薄蜡层,由气门周缘分泌蜡丝,后者泌蜡量大,为蜡丝结茧;雌性泌蜡主要在二龄若虫和雌成虫泌蜡形成卵囊期。FAS含量变化与泌蜡活动关系密切,在雄性的三龄若虫期最高,二龄若虫期次之,蛹期最低;雌性成虫泌蜡前和中期FAS含量最高,产卵完毕时最低,二龄若虫期居中;FAE含量与FAS变化相似,但在二龄若虫期也较高。这说明FAS和FAE参与了蜡质合成过程。

极长侧链脂肪酸生物合成抑制剂及其新品种应用

传统除草剂氯代乙酰胺、氧乙酰胺等是极长侧链脂肪酸生物合成抑制剂,此类除草剂的研究促使发现了除草剂设计中的新靶标—VLCFA延伸酶。Pyraxasulfone是芽前防治玉米与大豆田重要禾本科与阔叶杂草的除草剂,它抑制C18:0至C20:0阶段极长侧链脂肪酸生物合成,用量比氯代乙酰胺类品种低8～10倍。

延黄牛ELOVL6基因cDNA序列克隆及其在各组织间的表达差异

为研究超长链脂肪酸延伸酶6(ELOVL6)基因功能,本实验以延黄牛肝组织总RNA为模板,根据GenBank公布的基因序列设计引物,应用RT-PCR技术扩增ELOVL6基因,将扩增产物构建到PMD18-T载体进行测序,获得延黄牛ELOVL6完整CDS序列,应用生物信息学软件分析序列及其蛋白结构。以延黄牛心、肝、肺、肾、胃、十二指肠、皮下脂肪和背最长肌总RNA为模板,通过实时定量荧光PCR技术,检测ELOVL6基因在延黄牛各个组织间的表达差异。结果表明:延黄牛ELOVL6基因共编码264个氨基酸,预测其分子量为31.282 ku,理论等电点为9.46,为疏水性蛋白,无典型的信息肽切割位点,含有18个氨基酸磷酸化位点(分值>0.5),在延黄牛皮下脂肪组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。本研究首次成功克隆获得延黄牛ELOVL6基因CDS完整序列,对其结构、蛋白理化特性以及该基因在延黄牛各组织间的表达差异进行详细分析研究,为开展延黄牛ELOVL6基因的功能及肉质基因筛选的工作提供理论基础和科学依据。

ELOVL6基因研究现状

ELOVL6基因是超长链脂肪酸延伸酶（ELOVLs）家族成员之一,可以催化饱和和单不饱和脂肪酸的延伸,主要参与脂肪酸延伸和脂酰CoA的生物合成。目前对ELOVL6基因的研究主要集中在脂肪酸代谢、氧化应激、炎症反应等多种代谢性疾病方面,其在抑制某些肿瘤细胞中也发挥着重要的作用。ELOVL6作为牛的重要的脂肪酸代谢调控基因,国内外的研究相对较少,文章对国内外关于该基因的结构、表达情况和生理功能以及牛ELOVL6基因的研究进展进行了较为详细的综述。

重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因

目的通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。

精氨酸加压素基因多态性在广西人群中的分布

目的探讨精氨酸加压素(AVP)基因单核苷酸多态性(SNP)位点rs2282018、rs3787482和rs1887854在303例广西人群中的分布,并对比不同族群间AVP基因型及等位基因频率分布的差别。方法采用单碱基延伸的聚合酶链反应(PCR)技术和DNA测序法,检测303例广西人AVP基因多态性,分析广西人群3个位点的基因型和等位基因的分布频率,并与人类基因组计划(Hap Map)公布的欧洲人、中国北京汉族人、日本人和非洲人的基因多态性分型数据比较,分析这5个人群人类的基因型及等位基因的分布频率。结果我国广西人群AVP基因rs2282018、rs3787482及rs1887854位点各自具有3种基因型,基因型和等位基因分布与性别无关。与人类基因组计划(Hap Map)公布的欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人的单核苷酸多态性分型数据进行比较,广西人群AVP基因不同多态性位点的基因型和等位基因频率在不同地区人群的分布存在差异。结论广西地区人群中存在AVP基因多态性。广西人群AVP基因多态性的分布频率与其他不同地区种族人群比较存在差异。