快速激活延迟整流钾离子通道a亚基F129I突变致长QT综合征机制研究

目的:通过对1例长QT综合征2型患者疑似致病突变KCNH2(F129I)细胞电生理学研究,探究其细胞电生理学发病机制。方法:采用目标区域捕获高深度测序技术进行候选基因突变筛查;以脂质体转染技术通过HEK293细胞表达可疑致病突变。应用全细胞膜片钳技术记录HERG通道电流。结果:候选基因测序发现KCNH2基因第385核苷酸位点T>A杂合子错义突变,导致第129位密码子由苯丙氨酸变为异亮氨酸(F129I),进一步细胞膜片钳研究发现F129I突变型IKr电流密度显著减小,峰值电流抑制率约为野生型的86%。共转染野生型与F129I结果显示IKr电流显著恢复,与野生型差异无统计学意义。结论:本研究通过细胞电生理学研究证实患者携带KCNH2(F129I)致LQT2发生机制为HERG转运障碍,导致IKr功能减弱。

0.5 mT工频磁场对小鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾离子通道和动作电位的影响

目的 研究与日常生活密切相关的0.5 mT工频磁场对小鼠海马CA3区锥体神经元的影响.方法 采用急性分离的方法制备小鼠海马CA3区锥体神经元,用0.5 mT、50 Hz磁场对小鼠海马CA3区锥体神经元刺激30 min后,运用全细胞膜片钳技术研究其延迟整流钾通道电流,Ik和动作电位特性.结果 0.5 mT工频磁场照射小鼠海马CA3区锥体神经元30 min后,其电流密度减小,对照组和曝磁组最大电流密度分别为（171.05＋1.32）pA/pF、（139.65±2.37）pA/pF（n=12,P〈0.05）;对照组和曝磁组半数激活电压分别为（7.44±0.64）mV、（34.09＋6.48）mV（n=12,P〈0.05）;斜率因子分别为11.36±0.57、19.97±3.45（n=12,P〈0.05）;动作电位复极化时程APD90由（14.63±0.34）ms延长为（21.74±1.47）ms（n=12,P〈0.05）.结论 0.5 mT工频磁场可使小鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道电流Ik减小,通道开放延迟,通道激活速度减慢,动作电位复极化时间延长.

普鲁卡因对鼠大脑皮层锥体神经元延迟整流型钾离子通道电流的影响

目的 观察不同浓度普鲁卡因对新生鼠大脑皮层锥体神经元延迟整流型K+ 通道电流的影响 ,以探讨其中枢作用机理。方法 采取神经元急性分离法分离SD大鼠皮层锥体细胞 ,运用膜片钳内面向外式记录技术 ,记录不同浓度普鲁卡因对延迟整流型K+ 通道电流参数。根据普鲁卡因浓度不同分为 8个组 ,其浓度分别为 0、0 2、0 4、0 8、1 6、2 4、3 2和 4 0mmol/L ,每组以 7个不同钳制电压观测 1 1个样本。结果 当普鲁卡因浓度增至 0 4mmol/L时 ,其Ⅰ Ⅴ关系线斜率最小 ,通道的电导减至最低 [(36± 1 4) pS] ;此后随药物浓度的增加 ,Ⅰ Ⅴ关系线斜率增大 ,电导增加 ,并在2 4mmol/L增至最高 [(60± 2 0 )pS]。结论 普鲁卡因对鼠大脑皮层锥体神经元延迟整流型K+ 离子通道电流。

替米沙坦在牵张刺激导致的心室肌细胞延迟整流钾通道改变中的作用

目的:探讨替米沙坦在牵张刺激导致的心室肌细胞延迟整流钾离子通道改变中的作用。方法:将体外培养的乳鼠心室肌细胞分为对照组、牵张组、替米沙坦组、牵张+替米沙坦组。定量分析细胞蛋白/DNA比值及细胞培养上清中N-末端B型利钠肽原(NT-proBNP)水平以鉴定牵张有效性。实时荧光定量PCR检测延迟整流钾离子通道基因KCNH2、KCNQ1、KCNE1和KCNE2的mRNA水平;Western blot检测KCNH2和KCNQ1蛋白表达水平。结果:牵张刺激导致心室肌细胞蛋白/DNA比值增大和细胞培养上清中NT-proBNP水平升高。与对照组相比,牵张组KCNH2、KCNQ1、KCNE1和KCNE2 mRNA水平上调;替米沙坦可明显抑制牵张刺激引起的KCNH2、KCNQ1和KCNE1变化,而对KCNE2基因无显著抑制效应。与对照组相比,牵张组KCNH2和KCNQ1蛋白表达下调;与牵张组相比,牵张+替米沙坦组KCNH2和KCNQ1蛋白水平明显上调。结论:阻断血管紧张素受体可以抑制牵张刺激引起的心室肌细胞延迟整流钾通道改变。

AT1R信号在心力衰竭大鼠心室肌延迟整流钾通道表达中的作用

目的探讨充血性心力衰竭心室肌延迟整流钾通道表达改变及血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型(AT1R)的调控作用。方法SD大鼠40只随机分为4组:对照组、心衰组、替米沙坦(Tel)组及心衰+替米沙坦组。腹主动脉结扎构建心衰模型。干预前后超声测定左房前后径及左室后壁厚度。术后8周测血清NT-proBNP含量,心室肌组织切片HE染色,免疫印迹和实时定量RT-PCR检测延迟整流钾离子通道Kr和Ksα-亚基KCNH2、KCNQ1蛋白和mRNA表达。结果腹主动脉狭窄明显增加大鼠血浆中NT-proBNP含量,致左室后壁肥厚,HE染色心衰组心室肌细胞明显增大,证实腹主动脉狭窄致心肌肥厚、心力衰竭。心衰组KCNH2和KCNQ1mRNA表达上调、对应蛋白表达下调。Tel干预显著抑制心衰心室肌KCNH2和KCNQ1mRNA和蛋白表达的上述变化。结论心力衰竭时大鼠心室肌延迟整流钾通道Kr和Ks相关基因和蛋白表达发生改变,Tel干预可抑制上述效应,提示AT1R信号参与调控心衰心室肌细胞Kr和Ks的重构。

有氧运动对心力衰竭大鼠心室肌细胞钾通道重构的影响

目的:探讨有氧运动(AE)对充血性心力衰竭(CHF)大鼠心室肌细胞钾通道重构的作用及机制。方法:将SD大鼠随机分为假手术组、CHF组、假手术+AE组、CHF+AE组。建立CHF及假手术大鼠模型后,4组大鼠先进行适应性训练1周,假手术组、CHF组进行一般照护8周,假手术+AE组和CHF+AE组给予AE干预8周。各组饲养及训练结束后行超声心动图检测左室射血分数(LVEF)及左室后壁厚度(LVPWD),HE染色、天狼星红染色检测心肌组织形态学及纤维化程度,计算左室质量指数(LVWI),定量分析N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)水平,实时荧光定量聚合酶链反应检测快速激活延迟整流钾电流(IKr)编码基因KCNH2及慢激活延迟整流钾电流(IKs)α亚基编码基因KCNQ1的mRNA表达水平,Western blot检测KCNH2和KCNQ1蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,CHF组大鼠心肌组织损伤严重,LVEF明显降低,LVPWD、LVWI及NT-proBNP水平均明显升高;与CHF组比较,CHF+AE组大鼠心肌组织损伤明显减轻,LVEF明显升高,LVPWD、LVWI及NT-proBNP水平均明显降低(P均<0.05)。与假手术组比,CHF组KCNQ1及KCNH2的mRNA表达水平均明显上调;与CHF组比,CHF+AE组KCNQ1及KCNH2的mRNA表达水平均明显下调(P均<0.05)。与假手术组比,CHF组KCNQ1及KCNH2的蛋白表达水平均明显下调;与CHF组比,CHF+AE组KCNQ1及KCNH2的蛋白水平均明显上调(P均<0.05)。假手术组与假手术+AE组各指标差异无统计学意义。结论:AE参与调控CHF大鼠心肌结构与IKr、IKs离子通道重构。

hERG1a突变H70R对hERG1a单源四聚体和hERG1a/hERG1b二源四聚体通道功能的影响

目的本研究拟探索KCNH2编码心肌细胞快速延迟整流钾离子通道(rapidly activating delayed rectifier K^(+)channel,I_(Kr))α亚基(the human ether-à-go-go-related gene,hERG)转录产物——hERG1a特有突变H70R对hERG1a单源四聚体通道(I_(hERG1a))及hERG1a/hERG1b二源四聚体通道(I_(hERG1a/hERG1b))功能的影响,明确是否存在差异。方法以脂质体转染技术通过HEK293细胞表达可疑致病突变。应用全细胞膜片钳技术分别记录I_(hERG1a)、I_(hERG1a/hERG1b)电流。结果H70R对I_(hERG1a/hERG1b)电流密度抑制较I_(hERG1a)更为显著(61%vs 42%;P<0.001);且至稳态激活曲线左移,显著降低半激活电压(P<0.05);H70R对I_(hERG1a)和I_(hERG1a/hERG1b)通道灭活动力学无显著影响(P>0.05),I_(hERG1a/hERG1b)较I_(hERG1a)灭活显著加快(P>0.05)。结论H70R对I_(hERG1a及I_(hERG1a/hERG1b)通道功能影响趋势一致,但对I_(hERG1a/hERG1b)通道电流抑制更为显著,I_(hERG1a/hERG1b)较I_(hERG1a)灭活显著加快,提示在hERG相关临床致病突变研究中应重视I_(hERG1a/hERG1b)通道功能的改变。

细辛含药血清对SD大鼠DRG神经元I_K的影响

目的探讨细辛含药血清对SD大鼠延髓背侧呼吸中枢(DRG)神经元延迟外向整流钾离子通道(IK)的影响。方法将30只SD大鼠随机分为空白血清组和含药血清组各15只,禁食12h后分别灌服细辛散剂药液和等体积的生理盐水,每日1次,连续8d。末次灌胃2h后眼眶采血。室温下静置30min后取上清液,2500r/min离心25min,分离血清,置于56℃水浴30min灭活,过0.22μm微孔滤膜滤过除菌,分装,-20℃条件下保存备用。鼠龄1-3d的SD大鼠,雌雄不限,采用膜片钳WCR,分别记录空白对照组、空白血清组和含药血清组大鼠DRG神经元IK的变化。结果空白血清组与空白对照组相比,无显著性差异(P>0.01),而细辛含药血清与空白对照组、空白血清组相比均有非常显著性差异(P<0.01)。各组大鼠DRG神经元IK的生物特性无明显变化。结论细辛对延髓DRG呼吸神经元延迟外向整流钾离子通道(IK)的激活作用可能是细辛抑制呼吸中枢的离子机制之一。

Discovery of benzamide derivatives as potent Kv1.5 inhibitors

Kv1.5 potassium channel is reported as a potent and safe target for atrial fibrillation.CPUY11018 was proved it had moderate inhibition of Kv1.5.In order to improve the stability of CPUY11018,and investigate the structure-activity relationship,4 series of benzamide derivatives were synthesized and evaluated.Among them,8c is a most potent inhibitor of Kv1.5.

微管解聚对大鼠心肌细胞自主搏动和动作电位的影响及其机制

目的观察微管解聚对大鼠心肌细胞自主搏动频率、动作电位（AP）、耗氧量的影响并探究其机制。方法将180只SD大鼠乳鼠分12批处理进行实验，每批取15只大鼠乳鼠处死，剪取心脏组织分离培养心肌细胞，分别接种至1个铺有6块圆形盖玻片的12孔板、1个铺有6块方形盖玻片的12孔板、2个细胞培养瓶、2个细胞培养皿。将培养3d的各容器中细胞按随机数字表法分为正常对照组（加入3mL37℃复温的DMEM／F12培养液，常规培养3h）和微管解聚组（加入3mL37℃复温的含终浓度为8μmoL／L秋水仙碱的DMEM／F12培养液，常规培养3h），每组分别3孔、1瓶、1皿。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞微管形态变化，蛋白质印迹法检测细胞游离态及聚合态α微管蛋白的含量变化。倒置显微镜下观察并计算细胞自主搏动频率。氧微电极监测系统测定含有心肌细胞的DMEM／F12培养液加入秋水仙碱前后的溶解氧浓度，另测定单纯培养液和秋水仙碱＋培养液溶解氧浓度。采用全细胞膜片钳记录模式记录细胞AP、延迟整流型钾离子通道电流（Ik）和L型钙离子通道电流（Lca-L）变化，绘制电流密度-电压（I-V）曲线。对数据行独立或配对样本t检验。结果（1）正常对照组细胞微管结构完整，围绕核周呈放射状分布，线性管状结构清晰。微管解聚组细胞微管结构破坏，呈现弥散性分布，线性管状结构粗糙而不光滑。（2）微管解聚组细胞游离态d微管蛋白含量为0．61±0．03，明显高于正常对照组的0．46±0．03，t=6．99，P〈0．05；聚合态a微管蛋白含量为0．57±0．04，明显低于正常对照组的0．88±0．04，t=9．09，P〈0．05。（3）微管解聚组细胞自主搏动频率为（59±8）次／min，较正常对照组的（41±7）次／min明显增加（t=5．62，P〈0．01）。（4）含心肌细胞的培养液溶解氧浓度为（138．4±2．5）μLmol／L，秋水仙碱处理后下降为（121．7±3．6）μmol／L，差异明显（t=26．31，P〈0．05）。单纯培养液和秋水仙碱＋培养液溶解氧浓度无明显差异（t=0．72，P〉0．05）。（5）与正常对照组比较，微管解聚组细胞AP形态发生明显变化，复极化平台期不明显，动作电位时程（APD）明显缩短。微管解聚组细胞的APD20、APD50、APD90分别为（36．2±3．8）、（73．7±5．7）、（115．1±8．0）ms，较正常对照组的（40．2±2．3）、（121．4±7．0）、（169．4±5．6）mS明显缩短（t值分别为2．61、15．88、16．75，P值均小于0．05）。（6）微管解聚组细胞I。的I．V曲线较正常对照组上移，激活后各测试电压（0—40mV）下微管解聚组I。电流密度均高于正常对照组（t值为2．70-3．76，P值均小于0．05）。（7）2组细胞IC-a-L的I-V曲线基本重叠，激活后各测试电压（-30-50mV）下ICa-L。电流密度相近（t值为-1．57—1．66，P值均大于0．05）。结论微管解聚后Ik增强，IC-L变化不明显，使得AP复极化增快，进而缩短APD，加快大鼠心肌细胞自主搏动频率，增加其耗氧量。