南方根结线虫延长因子2基因cDNA全长克隆和序列分析

以南方根结线虫为材料,根据同源序列法分别进行3'末端和5'末端的RACE,获得延长因子基因2cDNA全长。此cDNA全长序列为2434bp,包括2334bp的完整ORF,编码一含777个氨基酸的多肽。该基因命名为Mi-eft2,其推导蛋白MI-EFT2的编码氨基酸与秀丽隐杆线虫的Ce-eft1,Ce-eft2,Ce-eft3,Ce-eft4基因的推导蛋白的同源性分别为26.7%、86.9%、13.8%和8.9%。蛋白功能分类预测MI-EFT2是一种在蛋白质延长过程中起作用的GTP水解酶,与真核生物的延长因子2功能相同。

真核细胞延长因子2基因RNA干扰慢病毒质粒的构建及验证

目的构建真核细胞延长因子2(eukaryotic elongation factor 2,eEF2)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,为后续研究eEF2在乳腺癌细胞发生发展中的作用提供实验依据。方法根据eEF2的基因序列和短发夹RNA序列的设计原则设计合成3对shRNA序列,将shRNA序列复性后插入慢病毒载体LV-U6-shRNA-ZSgreen-Puro,构建3种不同eEF2基因敲低靶点的重组质粒sh1、sh2、sh3,以空载体作为阴性对照组(shNC)。采用慢病毒三质粒包装系统共分别转染人肾上皮细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增。经酶切及测序验证正确后,将重组慢病毒感染对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7,72 h后荧光显微镜观察绿色荧光强度,实时荧光定量PCR(qPCR)法检测eEF2 mRNA转录水平,Western blot法检测eEF2蛋白表达水平。结果eEF2 shRNA载体测序与原设计序列完全一致。重组慢病毒感染的MCF-7中可见绿色荧光蛋白表达。与shNC组相比,eEF2敲低的sh2和sh3组MCF-7细胞中eEF2 mRNA的转录水平明显降低(t分别为9.244和5.938,P分别为0.001和0.004);sh1、sh2和sh3组细胞中eEF2蛋白的表达水平均明显降低(t分别为3.552、9.614和4.432,P分别为0.024、0.001和0.011)。结论成功构建了eEF2基因低表达的慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,有望为临床乳腺癌的治疗提供基于翻译靶向治疗的新靶点。

真核翻译延长因子1A2对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长和血管形成作用的研究

背景:人类真核翻译延伸因子1A2(EEF1A2)是一种管家基因,可能作为一种新的潜在癌基因,参与肿瘤的发生、发展。目的:探讨EEF1A2对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长和血管形成的作用。方法:以聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片段,应用基因重组技术构建Ad5/F35-EEF1A2重组腺病毒载体。15只裸鼠建立人胰腺癌移植瘤模型,随机分为对照组、绿色荧光蛋白(GFP)组和EEF1A2组,分别注射PBS0.1ml、Ad5/F35-GFP0.1ml(1×108PFU)和Ad5/F35-EEF1A20.1ml(1×108PFU)。测定各组肿瘤体积和质量,应用免疫组化方法检测各组增殖细胞核抗原(PCNA)和CD31的表达。结果:成功构建了表达EEF1A2的重组腺病毒载体。与对照组和GFP组相比,EEF1A2组裸鼠肿瘤体积和质量显著增加(P<0.05),PCNA和CD31表达显著增高(P<0.05)。结论:EEF1A2可显著促进人胰腺癌裸鼠移植瘤生长,细胞增殖和肿瘤血管形成可能是其重要作用机制。

eEF1A2在原发性肝细胞癌的表达

目的:研究真核翻译延长因子1A2(e EF1A2)在原发性肝细胞癌(HCC)组织的表达,以及e EF1A2过表达对HCC细胞生物学行为的影响。方法:应用real-time PCR法和免疫组化法分别检测62例HCC癌组织与配对癌旁组织、20例正常肝脏组织e EF1A2的mRNA和蛋白表达,应用real-time PCR法与Western blot法分别检测几种HCC细胞株e EF1A2的mRNA与蛋白表达。构建GV287-e EF1A2表达慢病毒感染低表达e EF1A2的HCC细胞,应用real-time PCR法和Western blot法分别检测细胞e EF1A2的mRNA和蛋白表达;应用MTT法、DNA倍体法和real-time PCR法分别检测细胞活力、细胞周期和白蛋白mRNA的表达。结果:HCC癌组织e EF1A2的mRNA表达水平和蛋白表达阳性率明显高于配对癌旁组织与正常肝脏组织(P<0.01);e EF1A2的mRNA和蛋白在HCC细胞株SMMC-7721和BEL-7402高表达,在SK-HEP-1低表达。构建的GV287-e EF1A2表达慢病毒可感染SK-HEP-1细胞使e EF1A2过表达;与阴性对照组相比,GV287-e EF1A2组SK-HEP-1细胞的活力升高,白蛋白的mRNA表达水平降低,G0/G1期的细胞比例显著减少,而S期和G2/M期的细胞比例显著升高。结论:e EF1A2在HCC癌组织存在异位高表达;e EF1A2可能是HCC的一种潜在癌蛋白,其过表达可增强HCC细胞的增殖能力,降低HCC细胞的分化程度,并促使细胞周期通过G0/G1期,进入S期和G2/M期。

eEF1A2基因沉默的原发性肝细胞癌BEL-7402细胞株的建立

目的本研究旨在构建针对高表达真核翻译延长因子1A2(eEF1A2)的原发性肝细胞癌(HCC)BEL-7402细胞株的eEF1A2-RNAi的细胞模型,为从基因沉默基因敲除层面研究eEF1A2在HCC潜在的致癌作用的功能奠定实验基础。方法通过针对eEF1A2基因的shRNA与线性化的GV115-GFP载体进行连接转化,对获得的重组子(GV115-GFP-eEF1A2-shRNA)进行PCR和测序鉴定。采用慢病毒载体系统将pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体与GV115-GFP-eEF1A2-shRNA共转染293T细胞,包装成eEF1A2-RNAi-LV,并感染高表达eEF1A2的BEL-7402细胞。采用Real time PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平验证eEF1A2-RNAi-LV对BEL-7402细胞eEF1A2表达的抑制作用。结果成功构建了重组真核表达载体GV115-GFP-eEF1A2-shRNA,并通过慢病毒载体系统包装成eEF1A2-RNAi-LV;将eEF1A2-RNAi-LV转染至BEL-7402细胞后,细胞eEF1A2 mRNA和蛋白的表达水平分别下降了84.1%和64.5%,与阴性对照组相比较具显著性差异(P<0.01),表明转染后的BEL-7402细胞eEF1A2基因被特异性沉默。结论成功构建了eEF1A2-RNAi的BEL-7402细胞模型,为进一步从基因敲除层面研究eEF1A2在HCC潜在的致癌作用奠定了良好的实验基础。

EZH2、EAF2在NSCLC中的表达及意义

目的探讨果蝇Zeste基因增强人类同源物(Enhancer of Zeste Homolog,EZH2)、RNA聚合酶2延长因子相关因子-2(RNA polymeraseⅡelongation factor-associated factor 2,EAF2)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及意义。方法选取2016年1月至2018年3月我院保存的NSCLC组织110例,同时选取癌旁组织作为对照,采用免疫组化染色法检测EZH2、EAF2表达。结果 NSCLC组织EZH2阳性表达率为61.82%,明显高于癌旁组织(P<0.05),而EAF2阳性表达率为34.55%,明显低于癌旁组织(P<0.05);Ⅲ期、中低分化、有淋巴结转移患者EZH2阳性表达率分别为83.33%、76.32%和86.54%,明显高于Ⅰ-Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者(P<0.05),而EAF2阳性表达率分别为11.11%、15.79%和15.38%,明显低于Ⅰ-Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者(P<0.05);EZH2和EAF2表达呈负相关(r_s=-0.531,P<0.05)。结论 EZH2在NSCLC中呈高表达,而EAF2呈低表达,与患者临床病理特征有一定的相关性。

人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P、L和M2-1重组质粒的构建和鉴定

目的构建可表达人呼吸道合胞病毒(RSV)转录延长/终止抑制因子M2-1(简称M2-1)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的真核表达载体并鉴定蛋白表达情况。方法采用合成T7启动子Oligo DNA及PCR方法获得含有T7启动子的表达盒,通过体外连接方法克隆入载体px8δT,制备表达载体px8δT-PT。设计3对PCR引物,PCR扩增出RSV的M2-1、N和P基因,并克隆至px8δT-PT,构建px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N和px8δT-PT-P。同时利用已有的质粒pcDNA3.1-L构建px8δT-PT-L。用重组质粒转染BSR T7/5细胞,72 h后再用Western blot法鉴定蛋白的表达。结果成功实现px8δT的改造,构建的4种重组质粒px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P和px8δT-PT-L,经限制性内切酶分析与预期一致,经Western blot法分析证实M2-1、N及P蛋白被表达。结论获得以T7为启动子的表达载体px8δT-P,成功构建了含有M2-1、N及P编码基因的表达载体,为利用反向遗传学技术进一步改造RSV奠定了基础。

Eftud2对星形胶质细胞炎症的作用研究

背景创伤性脑损伤后异常激活的神经炎症是预后不良的主要原因之一,星形胶质细胞在炎症发展中具有促进修复或加重损伤的双重作用。延长因子Tu GTP结合域蛋白2(elongation factor Tu GTP binding domain containing protein,Eftud2)是免疫调节因子,在炎症和肿瘤的发生发展中均具重要作用。目的观察Eftud2对星形胶质细胞炎症的影响。方法小鼠随机分为假手术组和创伤性脑损伤组,使用经典控制性皮质撞击装置构建创伤性脑损伤模型。免疫荧光观察损伤前后S100β和Eftud2含量变化。转棒和平衡木实验评估小鼠造模前后运动功能的改变。实时荧光定量PCR检测损伤前后组织中IL-1β、TNF-α、NLRP3转录水平变化。使用小干扰RNA敲低小鼠星形胶质细胞(mouse astrocyte,MA)中的Eftud2,而后使用脂多糖刺激MA细胞系模拟炎性状态,实时荧光定量PCR检测MA细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α、GM-CSF、CXCL-10、IL-10、MyD88转录水平变化,蛋白质免疫印迹检测MA细胞中Eftud2和MyD88的蛋白表达变化。结果动物实验中,与假手术组相比,创伤性脑损伤组小鼠损伤部位Eftud2和S100β荧光强度增加(P<0.01),损伤组织周围炎性因子IL-1β、TNF-α、NLRP3转录水平升高(P<0.01)。细胞实验中,用脂多糖刺激后,MA细胞中Eftud2蛋白表达水平上调(P<0.05),同时Eftud2转录水平和单细胞荧光强度也升高(P<0.01)。给予小干扰RNA后,敲低组MA细胞中Eftud2蛋白表达水平、转录水平和单细胞荧光强度均显著下降(P<0.01)。敲低MA细胞中的Eftud2并给予脂多糖刺激后,实时荧光定量PCR结果显示,IL-6转录水平下降(P<0.05),IL-1β、TNF-α、GM-CSF、MyD88和CXCL-10转录水平也下降(P<0.01),抗炎因子IL-10转录水平升高(P<0.05)。蛋白免疫印迹结果显示,MyD88蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论Eftud2可能通过MyD88介导的信号通路调控星形胶质细胞的炎症反应,其作用机制有待进一步研究。

RNA聚合酶2延长因子相关因子2可通过调节胞外信号调控激酶的磷酸化抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移

目的 探讨RNA聚合酶2延长因子相关因子2（EAF2）对前列腺癌细胞增殖和迁移能力的抑制作用与细胞内细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化的关系。方法 采用RNA干扰（RNAi）方法干扰前列腺癌细胞C4-2和22Rv1中EAF2的表达，采用Western blot方法检测细胞内ERK磷酸化水平的变化；采用质粒转染的方法在293T细胞中过表达EAF2后检测ERK磷酸化水平的变化；分别采用溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记法和Transwell小室法检测干扰EAF2表达对前列腺癌细胞增殖和迁移能力的影响，利用ERK抑制剂PD184352同时抑制ERK磷酸化后，进一步检测细胞增殖和迁移能力的变化。结果 干扰EAF2表达后ERK的磷酸化水平明显升高。过表达EAF2的表达后ERK的磷酸化水平进行性下降，在C4-2细胞中干扰EAF2的表达，检测到增殖细胞的百分比从（19.7±1.5）%升高至（30.8±0.8）%（P＝0.001）。但同时抑制细胞中ERK的磷酸化后，增殖细胞的百分比从（30.8±0.8）%降至（21.9±0.5）% （P＝0.013）。在C4-2细胞中干扰目标基因EAF2的表达后，检测到迁移细胞的数量从（104±12）个升高至（203±17）个（P＝0.002）。但同时抑制细胞中ERK的磷酸化后，迁移细胞的数量从（203±17）个降至（123±11）个（P＝0.011）。结论 EAF2的表达和ERK的磷酸化水平相关，EAF2可能通过调节ERK的磷酸化水平调控前列腺癌细胞增殖和迁移的能力。

靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2可抑制胰腺癌细胞BxPC-3体外迁移和侵袭

目的:探讨靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2(homo sapiens eukaryotic translation elongation factor 1alpha 2,EEF1A2)对胰腺癌BxPC-3细胞体外迁移和侵袭的影响及其可能的分子机制。方法:应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测4种胰腺癌细胞株中EEF1A2的mRNA和蛋白表达水平。将EEF1A2-小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和阴性对照siRNA转染到BxPC-3细胞中,随后采用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测EEF1A2的mRNA及蛋白表达,应用体外划痕和Transwell侵袭实验分别检测BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中p-Akt和总Akt蛋白的表达变化。结果:4种胰腺癌细胞株中除SW1990细胞呈EEF1A2低表达外,BxPC-3、Patu8988和Panc-1细胞均呈EEF1A2高表达。EEF1A2-siRNA转染BxPC-3细胞48 h后,EEF1A2 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照siRNA转染的细胞和空白对照细胞明显降低(P<0.01)。EEF1A2-siRNA转染组BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于阴性转染对照组和空白对照组(P<0.05)。EEF1A2-siRNA转染组细胞中Akt的磷酸化水平明显低于对照组细胞(P<0.05),而总Akt蛋白表达水平未显著改变(P>0.05)。结论:siRNA干扰下调EEF 1A 2基因表达可明显抑制胰腺癌BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭,其机制可能与EEF1A2调控Akt信号通路有关。

RNA聚合酶2延长因子相关因子2通过调节骨髓基质抗原2的表达调控前列腺癌细胞的增殖与迁移

目的 观察雄激素应答基因RNA聚合酶2延长因子相关因子2（EAF2）对骨髓基质抗原2（BST2）的调节能力，以及EAF2通过BST2调节前列腺癌细胞增殖和迁移的能力。方法 以Lipofectamine 2000试剂转染针对EAF2和非特异性对照组的小干扰RNA（siRNA，分别为100 pmol），干扰前列腺癌细胞C4-2中EAF2的表达，采用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）和Western blot检测细胞内BST2的mRNA和蛋白水平表达变化；采用质粒转染的方法在293T细胞中过表达EAF2后检测BST2蛋白水平的变化，明确EAF2对BST2表达的影响；采用溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记法和Transwell小室法计算并检测干扰BST2表达后对前列腺癌细胞C4-2增殖能力和迁移能力的影响，明确BST2对前列腺癌细胞增殖和迁移的调节能力。结果 干扰EAF2表达后细胞内BST2 mRNA的表达明显升高，说明EAF2可以调节BST2的转录水平，进一步检测干扰EAF2表达后，BST2的蛋白水平表达明显升高，进一步干扰BST2表达后，检测到前列腺癌细胞的增殖比例由（22.09±1.08）%下降至（12.25±1.32）%（P＝0.001）。同时，迁移细胞的数量从（50.50±3.80）%下降至（24.25±1.42）%（P＝0.001）。结论 在前列腺癌细胞中，EAF2可以在转录和蛋白水平调节BST2的表达，BST2具有调节前列腺癌细胞增殖和迁移的能力。

人类真核翻译延长因子1A2过表达对胰腺癌SW1990细胞体外侵袭及体内转移的影响

目的探讨人类真核翻译延长因子1A2（EEFlA2）过表达对人胰腺癌SW1990细胞体外侵袭和肺转移潜能的影响。方法通过携带EEFlA2的慢病毒感染人胰腺癌SW1990细胞建立EEFlA2稳定过表达的SW1990／EEFlA2细胞株及空质粒对照的SW1990／GFP细胞株，并以亲本SW1990细胞作为空白对照。采用实时PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞EEFlA2mRAN和蛋白的表达。应用Transwell小室检测细胞的体外侵袭能力。通过裸鼠尾静脉注射癌细胞方法构建肺转移模型，8周后观察并计数肺表面的转移结节。结果SW1990／EEFlA2细胞EEFlA2mRNA相对表达量为3．252±0．344，显著高于SW1990／GFP细胞的1．000±0．060及亲本细胞的0．944±0．041（t值分别为2．255、2．305，P值均〈0．01）；EEFlA2蛋白表达量为0．833±0．050，显著高于SW1990／GFP细胞的0．247±0．035及亲本细胞的0．273±0．041（t值分别为0．572、0．559，P值均〈0．01）；穿膜细胞数为（60±4）个，显著多于SW1990／GFP细胞的（33±4）个和亲本细胞的（26±3）个（t值分别为31．33、34．78，P值均〈0．01）；裸鼠肺转移结节显著多于SW1990／GFP细胞及亲本细胞组（5／5比1／5、1／5，P值均〈0．05）。结论EEFlA2过表达可以明显增强胰腺癌SW1990细胞的体外侵袭和肺转移能力。

真核延伸因子2激酶与肿瘤

真核延伸因子2激酶(e EF2K)是一种Ca2+/Ca M依赖性蛋白激酶,e EF2是其已知的唯一底物。e EF2K催化e EF2的Thr56位点发生磷酸化,导致降低e EF2与核糖体的结合能力进而抑制肽链延伸。现已发现,e EF2K在多种肿瘤细胞中高表达或高度活化,参与肿瘤进程的调控,因此e EF2K可能是一个潜在的肿瘤治疗靶点。本文就e EF2K的结构、功能、与肿瘤的关系及其抑制剂的研究进展进行综述。

植物介导的RNA干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的转基因番茄的研究

本研究构建了植物干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的载体pBI-RNAi;建立了番茄再生体系和番茄农杆菌侵染后的再生体系;并利用该体系转化了对照空载体pBI121和干扰载体pBi-RNAi,经过卡那霉素抗性筛选和基因组DNA中报告基因及RNAi片段的PCR检测筛选,一共获得5株pBI121转化的阳性植株,获得9株p BI-RNAi转化的阳性植株。该研究为今后进行转基因植株介导的干扰线虫目的基因的表达,降低线虫侵染能力的研究奠定了基础。

靶向封闭EEF1A2对胰腺癌细胞凋亡的作用及其机制研究

目的 观察靶向封闭EEF1A2基因对胰腺癌细胞株凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 体外转录制备2对EEF1A2 siRNA,应用脂质体技术转染胰腺癌细胞株BxPC-3,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后EEF1A2基因表达的变化.运用膜联蛋白V/碘化丙啶法检测细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测细胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9、聚二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP）细胞色素C和Bid等凋亡相关蛋白表达变化.结果 2对EEF1A2 siRNA均能有效降低BxPC-3细胞中EEF1A2的表达,其中第2对siRNA静默效果更佳,EEF1A2在mRNA和蛋白质水平的表达抑制率均达75%左右.抑制BxPC-3细胞中EEF1A2的表达后,细胞的早期凋亡率为15.28%±3.65%,显著高于阴性对照组的10.11%±3.05%和空白组的9.41%±4.14%,同时伴随出现caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP和Bid的蛋白活化增强和细胞色素C表达增加.结论 抑制EEF1A2表达能明显诱导胰腺癌细胞BxPC-3的凋亡,而死亡受体途径和线粒体途径的激活可能均参与凋亡的发生.