白蛋白浓度对开放式细管玻璃化冷冻猪卵母细胞线粒体基因和凋亡基因表达水平的影响

为了探讨不同浓度白蛋白在猪卵母细胞开放式细管(OPS)玻璃化冷冻保存中对线粒体基因(SOD1、Mfn2)和凋亡基因(BAX)表达和甲基化的影响,试验采集新鲜的健康长白猪卵巢中的猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs),将其分为空白对照组和试验1,2,3组,分别用含0、1.5%、2.0%、2.5%白蛋白的冷冻保护液(TCM-199+10%胎牛血清+5%乙二醇)进行OPS玻璃化冷冻、解冻,通过RT-qPCR、激光共聚焦方法分析SOD1、Mfn2和BAX基因的表达水平及甲基化的情况。结果表明:与空白对照组比,试验1,2组SOD1基因表达水平上调,其中试验2组差异显著(P<0.05),试验1组差异不显著(P>0.05);试验3组SOD1基因表达水平下调,但与空白对照组差异不显著(P>0.05)。试验1,2,3组Mfn2基因表达水平均下调,其中试验1,2组与空白对照组均差异显著(P<0.05),试验3组与空白对照组差异不显著(P>0.05)。试验1,2组BAX基因表达水平下调,其中试验2组与空白对照组差异显著(P<0.05),试验1组与空白对照组差异不显著(P>0.05);试验3组BAX基因表达水平上调,但与空白对照组差异不显著(P>0.05)。试验1,2,3组5-mC、5-hmC的AO值均降低,其中试验1组5-mC的AO值与空白对照组差异显著(P<0.05),试验2,3组5-mC的AO值与空白对照组均差异不显著(P>0.05);试验1,2,3组5-hmC的AO值均显著减低(P<0.05)。说明白蛋白在猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻中可减少超低温对细胞造成的损伤,对细胞有保护作用,其中添加2.0%白蛋白对细胞的保护效果最显著。

小鼠卵母细胞的OPS法玻璃化冷冻保存技术

目的以小鼠卵母细胞为模型,利用开放式拉长细管(open pulled straw,OPS)法研究在不同条件下冷冻、解冻对其发育能力的影响,为家畜、濒危动物乃至人类探索一种简易、高效的卵母细胞冷冻保存提供理论与技术参考。方法在室温(25℃±0.5℃)条件下,以乙二醇(EG)、DMSO为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液(EFS、EDFS),采用OPS法对卵母细胞进行玻璃化冷冻保存。实验一:操作台温度分别为25℃±0.5℃和37℃±0.5℃时,卵母细胞在10%EG+10%DMSO或10%EG溶液中预处理30 s,移入EDFS或EFS中平衡15 s^45 s进行冷冻保存;实验二:操作台为37℃±0.5℃条件下,采用三种方法(卵母细胞在A:0.5 mol/L和0.3 mol/L的蔗糖中分别处理2 min和5 min;B:0.3 mol/L和0.15 mol/L的蔗糖中分别处理5 min和2 min;C:0.5 mol/L的蔗糖处理5 min)对EDFS30和EDFS40冷冻保存的卵母细胞进行解冻;实验三:解冻后的卵母细胞在SrCl2溶液中进行孤雌激活。结果与结论实验一中卵母细胞解冻后的形态正常率分别高达92.1%(25℃±0.5℃)和92.5%(37℃±0.5℃),均与对照组(98.9%)无显著性差异(P>0.05);实验二中卵母细胞解冻以C法效果最佳(形态正常率分别为92.5%和67.5%);实验三中解冻后在mCZB中培养0.5 h的卵母细胞激活效果优于未培养组(卵裂率和囊胚发育率分别为80.0%vs.57.7%;18.2%vs.0),均有显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01);而培养组与新鲜对照组卵母细胞激活后卵裂率和桑椹胚发育率与对照组(80.0%vs.77.8%;52.8%vs.61.9%)均无显著性差异(P>0.05)。