基于开放染色质的全基因组水平转录调控元件的研究方法与进展

真核生物转录调控过程是大量的顺式调控元件与反式作用因子相互作用的结果.研究发现,这一调控过程与染色质核小体的动态定位相关,调控因子的结合需要裸露的无核小体的DNA区域,即开放的染色质位点.因此,高效精确地定位基因组上的开放染色质位点为成功地发掘基因组调控元件,乃至揭示基因表达调控机制提供了重要线索和有效手段.本文对开放染色质位点的定义、主要研究方法以及功能注释进行概述,希望对在基因组水平上调控元件的发掘,尤其是在植物中的应用提供借鉴.

乳腺癌中基于开放染色质的环状RNA互作网络构建及功能分析

目的发现乳腺癌中重要的环状RNA(circular RNA,circRNA)及其参与的分子生物处理过程。方法全基因组范围内分析3种乳腺癌细胞系:MCF-7、T-47D、MDA-MB-231的脱氧核苷酸酶Ⅰ超敏感位点高通测序数据(DNaseⅠhypersensitive sites sequencing,DNase-seq)和转座酶可接近性染色质高通测序数据(assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing,ATAC-seq),筛选出捕获的基因编码序列上对应的活化circRNA,然后基于KEGG pathway对活化circRNA基因进行富集筛选,在此结果中选取3个细胞系共有的活化circRNA基因,依据Gene Ontology的分子生物过程构建乳腺癌活化circRNA基因互作网络。结果表达调控网络识别出111个关键功能模块,主要分为调控类和反应类,此外还包括一些重要的信号通路。将活化circRNA基因互作网络中,连接度大于50的活化circRNA基因定义为hub基因,hub基因对应的circRNA定义为hub circRNA,它们是:PTK2B、PDCD6IP、ABL1、EGFR、RHOA、MTOR、NRP1、ATR、CTNNB1、ILK、NF1、PRKCA、HNRNPK、MEF2C、PMAIP1、LYN、NR4A3、SRF、AREG、PML、PTK2、ROCK2、TGFBR2、VEGFA、DLG1、HRAS、ITGA2、CREB1、STAT3、RUNX2和TIAM1。结论乳腺癌细胞染色质中处于活化状态的circRNA,其参与的生物过程主要是正、负调控细胞周期、凋亡、增生、分化等重要的细胞生物过程,因此表明circRNA在乳腺癌的发生发展过程中起到重要作用。

利用染色质开放性测序技术探讨叶酸缺乏对胚胎干细胞基因组结构变化调控影响

目的 利用染色质开放性测序技术(ATAC-seq)探讨叶酸缺乏对小鼠胚胎干细胞(mESC)全基因组染色质结构影响特征。方法 使用4mg/ml浓度的正常叶酸培养基培养mESC24h作为正常对照组,使用终浓度为0.12μM的叶酸代谢障碍药物甲氨蝶呤(MTX)处理mESC24h作为MTX实验组,分别行ATAC-seq,获得胚胎早期全基因组染色质开放图谱。进行正常对照组及MTX实验组染色质开放区域数量、开放区域涉及基因功能及通路分析比较。结果 确立转座酶Tn57.5U消化正常对照组mESC,Tn55U消化MTX实验组mESC,获得清晰核小体周期条带建立ATAC-seq测序体系,分别设置3个生物学重复进行二代测序。MTX处理后开放性染色质结构数量明显减少(P<0.05);MTX处理后差异染色质开放区域主要集中在胚胎器官形成、细胞周期调控、神经骨骼系统发育及生殖系统发育有关基因(P<0.01);MTX实验组和正常对照组差异基因显著性富集pathway集中在MAPK信号通路、细胞骨架调控、Rap1信号通路等(P<0.01)。结论 叶酸缺乏能够引起mESC基因组染色质开放性结构变化,涉及器官形成、细胞周期调控等重要发育基因及生理代谢通路相关基因,可能引起后续基因表达调控改变。

染色质开放状态对结肠癌相关功能通路影响的生物信息学分析

目的利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库的染色质开放性高通量测序(ATAC-seq)数据和转录组测序(RNA-seq)数据,探索染色质开放状态对结肠癌相关功能通路的影响。方法从TCGA数据库下载结肠癌ATAC-seq数据和RNA-seq数据,使用R 3.5.3软件对ATAC-seq数据进行质量控制。对全部样本ATAC-seq数据峰值(peaks)进行基因注释,对所注释基因进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。选择结肠癌关键基因肿瘤抑制基因APC(APC)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、v-raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF),对3个基因的启动子区ATAC-seq数据peaks与RNA-seq的每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数(FPKM)进行Pearson相关性分析。对TNM分期Ⅲ+Ⅳ期和Ⅰ+Ⅱ期的组织样本进行差异ATAC-seq数据peaks分析,并对上调和下调peaks注释基因进行KEGG通路富集分析。结果结肠癌ATAC-seq数据peaks在染色体分布均匀,大多数分布于启动子区(距离转录起始位点≤1 kb、>1~2 kb、>2~3 kb者分别占30.17%、5.42%、3.88%)和远端基因间区(26.17%),符合染色质开放区2种主要类型的分布。GO功能和KEGG通路富集分析结果显示,结肠癌ATAC-seq数据peaks注释基因显著富集于癌症相关功能和通路,如Wnt信号通路的细胞间信号转导、表皮生长因子受体(ErbB)信号通路等。结肠癌关键基因APC、KRAS、BRAF启动子区ATAC-seq数据peaks与其RNA-seq的FPKM呈正相关。TNM分期Ⅲ+Ⅳ期相对Ⅰ+Ⅱ期患者上调peaks注释基因显著富集于ErbB信号通路、Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路等增殖、侵袭和转移相关信号通路,下调peaks注释基因显著富集于T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、细胞黏附分子信号通路等免疫识别相关信号通路。结论染色质开放状态对结肠癌相关功能通路调控起着重要作用。

衰老细胞染色质开放变化的初步分析

为研究复制性衰老中表观遗传学的变化,以年轻代龄(PD26)和年老代龄(PD55)的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)为材料,进行ATAC-seq测序,并使用Bowtie2、FastQC、MACS、deepTools、phastCons、R语言、HOMER以及基因本体论(Gene Ontology,GO)对测序结果进行深入分析和挖掘。结果显示,2BS细胞染色质开放区域的保守性较强,其主要集中于启动子(promoter)区至转录起始位点(transcription start site,TSS),且年轻细胞与年老细胞的启动子区至转录起始位点的开放程度不同,细胞随着衰老在启动子区至转录起始位点的开放程度逐渐下降。进一步对年轻和年老细胞之间存在显著差异的靶基因进行GO分析发现,这些差异基因主要与细胞进程、代谢、生物性调节、结合功能、催化功能相关。本次研究发现衰老过程中染色质开放区减少、转录调控水平下降,提示复制性衰老与转录调控关系密切。

利用ATAC-seq技术研究Ⅰ型干扰素通路活化后人单核细胞的染色质开放性改变

目的检测人单核细胞经干扰素α(interferon α,IFNα)刺激后在全基因组水平上的染色质开放性变化。方法收集健康人外周血单核细胞,运用基于转座酶和高通量测序的染色质分析(assay for transposase-accessible chromatin using sequencing,ATAC-seq)技术检测染色质开放性。使用生物信息学工具进行富集分析和可视化分析。结果经过 IFNα处理后,染色质开放性发生显著增加的区域有 430 个,显著降低的区域有 442 个;大部分开放结构位于基因的启动子和临近区域,其次是基因间区域以及基因的内含子区域。富集分析显示,染色质开放性明显增加的区域所关联的基因涉及的生物学过程大多是与干扰素相关的信号通路和抗病毒反应。可视化相应的染色质区域,效应性干扰素诱导表达基因(interferon-stimulated gene,ISG)的启动子及转录起始位点区域在 IFNα刺激之后 ATAC-seq 信号强度明显增强;而调节性 ISG 在 IFNα刺激前即已具备一定程度的开放性,刺激之后开放性有所增强。开放性增强区域含有干扰素刺激反应元件以及干扰素调控因子等重要转录因子的识别基序。结论Ⅰ型干扰素刺激后,人单核细胞的染色质开放性发生了特征性改变,为下游的相关基因表达做出准备。

染色质开放性与动物胚胎发育关系的研究进展

染色质开放性是指核小体或转录因子等蛋白与真核生物染色质DNA结合后,对其他蛋白能否再结合的开放程度,这一特性能够反映转录活性。染色质结构是动态变化的,染色质开放性与动物生长发育、细胞分化等过程密切相关,基因组开放染色质高效精准定位可为解析基因表达调控机制提供重要线索。本文介绍染色质开放性检测方法、染色质开放性的影响因素,重点阐述染色质开放性与动物发育的关系并对其发展及应用前景进行阐述,以期为动物发育基因表达调控等相关研究提供参考依据。

心肌肥大基因差异表达及染色质开放性的高通量测序

目的运用转录组测序(RNA-seq)和染色质开放性测序技术(ATAC-seq),探讨心肌肥大发生后基因差异表达以及特征基因开放性。方法将12只小鼠随机分为心肌肥大组和对照组(各6只),分别腹腔注射血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和生理盐水。应用超声和免疫组化方法检测心肌肥大和纤维化程度,RNA-seq、实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测并验证基因的表达,ATAC-seq方法检测染色质开放性。结果与对照组比较,心肌肥大组心肌发生肥大和纤维化。高通量测序技术获得与心肌功能相关的差异表达基因,qPCR检测显示marker基因的表达量和染色质开放水平均较对照组增高。结论心肌肥大后,基因的转录表达和染色质开放性皆发生变化,尤其是marker基因。

动物早期胚胎发育中染色质结构的继承和重编程

染色质开放性和染色质三维高级结构在基因表达和调控中发挥着非常重要的作用,广泛参与分化、发育、肿瘤发生等细胞生理过程,是表观遗传研究的热点领域之一。动物胚胎发育起始于终端分化的卵子受精形成全能性的受精卵。在精卵结合的过程中,染色质开放性和染色质三维高级结构发生了剧烈的变化,经历继承、重编程、重新建立的过程,并指导调控受精卵分化发育最终成为多细胞、多器官组织的新生命个体。本文介绍了近年来研究染色质开放性和染色质三维高级结构的实验分析技术手段,染色质结构在动物早期胚胎发育过程中的变化规律及其在早期胚胎发育中的作用,染色质结构与其他表观遗传信息(甲基化、组蛋白修饰等)关系方面的重要研究进展和存在的科学问题,以期为表观遗传调控早期胚胎发育的研究提供参考。

染色质转座酶可及性测序研究进展

染色质转座酶可及性测序(assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing,ATAC-seq)诞生于2013年,具有比脱氧核糖核酸酶I超敏感位点测序(deoxyribonuclease I hypersensitive site sequencing, DNase-seq)和微球菌核酸酶敏感位点测序(micrococcal nuclease sequencing, MNase-seq)更快速、灵敏、简便的优点,是目前分析全基因组范围染色质开放区域的热点技术。通过该技术能获得染色质开放区域的相关信息,从而映射出转录因子等调控蛋白的结合区域和核小体定位等信息,对于研究表观遗传分子机制具有重要意义。本文比较了5种获取染色质开放区域技术的优缺点,重点介绍了ATAC-seq的原理和主要流程,描述了利用ATAC-seq技术研究染色质开放区域的发展概况以及ATAC-seq的相关应用,期望对真核生物全基因组水平的染色质开放区域研究、顺式调控元件鉴定以及遗传调控网络的解析等提供借鉴。

乳腺生物反应器的表达优化策略

乳腺生物反应器是指将外源基因导入动物基因组并在动物乳腺中特异性表达,利用动物乳腺合成、分泌蛋白的功能,在其乳汁中获得外源蛋白的技术。乳腺生物反应器凭借其高表达、低成本以及合成蛋白质的结构接近天然蛋白质等优势而被视为药用和营养蛋白生产的一次技术革新,然而由于外源基因随机整合以及重组蛋白表达不稳定等问题极大地限制了其应用。本文结合乳腺生物反应器的发展现状,从利用基因编辑技术、筛选合适的外源基因整合位点以及改进外源基因调控序列3个方面对乳腺生物反应器优化策略进行了综述,以期为提高乳腺生物反应器生产重组蛋白的表达提供理论借鉴。

染色质调节元件与不同启动子的相互作用对基因表达调控的影响

为探究DNA序列元件对不同启动子调节转基因稳定表达的影响,利用遍在染色质开放元件(Ubiquitous chromatin opening elements,UCOE)和基质黏附序列(Scaffold/matrix-attachment regions,MAR)分别与含增强子的oct4基因启动子、含CpG岛的sox2基因启动子和不含调控元件的nanog基因启动子以及同时包含增强子和CpG岛的CMV启动子组合构建pOCT4-MAR、pOCT4-UCOE、pSOX2-MAR、pSOX2-UCOE、pNANOG-MAR、pNANOG-UCOE、pCMV-UCOE、pCMV-MAR等质粒,分析这些质粒稳定转染后的表达量和嵌合表达差异。结果发现,UCOE与含增强子元件的oct4启动子组合能较稳定高效表达,而MAR与含CpG岛的sox2启动子组合能较稳定高效表达。利用排除位置效应原因的嵌合表达对染色质高级结构调控基因表达的稳定性分析表明:(1)通常情况下UCOE比MAR调节的表达载体的表达更高效和更稳定;UCOE连接含CpG岛的启动子形成开放染色质调节的高表达更稳定;(2)MAR与启动子上TATA盒或增强子可能通过染色质环产生高表达,但相对不稳定。结论:染色质调节元件UCOE和MAR与启动子调控元件之间能通过染色质开放状态或染色质环调控基因稳定表达。

母源-合子转换期中合子基因组激活的研究进展

母源-合子转换(Maternal-to-Zygotic Transition,MZT)是早期胚胎发育过程中母体产物到新生合子基因组发育控制的关键,包括母体成分(mRNAs和蛋白质)降解和合子基因组激活(Zygotic Genome Activation,ZGA)。虽然这两个阶段的基因调控模式不同,但在MZT中这些变化精确控制和高度关联。本文综述了ZGA过程中细胞周期、染色质和转录因子调控胚胎基因表达的特定模式,以及ZGA翻译后调控的变化,阐明了ZGA在MZT过程中的分子调控机制,为进一步研究MZT中基因表达的大规模变化提供理论基础。

原始生殖细胞的命运决定

精子和卵子结合而成的受精卵是一个新生命的开始。受精卵不断分裂、分化,在经过胚胎发育、器官形成等过程后长成新个体。其中部分细胞成为原始生殖细胞,它们是新个体产生精子或卵子的源泉,这里所发生的一切将决定新个体后代的命运。

哺乳动物细胞表达系统研究进展

目前,哺乳动物细胞已成为生产多种生物药物的首选宿主细胞。哺乳动物细胞表达系统可进行翻译后修饰,表达的重组蛋白接近人源构象,因此被大量用于治疗性重组蛋白的生产,如何建立高效的哺乳动物细胞表达系统也受到研究者们的重视。随着基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学研究不断深入,近几年来在优化哺乳动物表达系统方面取得了长足的进步。从高效表达载体构建、宿主细胞改造、高通量筛选、培养基优化等方面阐述哺乳动物细胞表达系统的研究进展,以期为研究者们提供一定的帮助。

表观遗传信息在动物中的跨代遗传和重编程

在动物早期发育过程中,无论是生物个体的形态还是基因的表达都发生了巨大的变化,而表观遗传信息在此过程中起着重要的作用.近年来,随着基因组等技术的发展,人们对不同表观遗传信息在配子形成、跨代遗传和早期发育过程中的认识越来越丰富,发现在这些过程中往往会出现全基因组层次的重编程.本文主要介绍了DNA甲基化、染色质开放性、组蛋白修饰及染色体三维结构这些表观遗传信息在跨代遗传和胚胎发育时期的重编程的进展,以及不同物种间的保守性和进化性.