痘苗病毒天坛株基因组旁侧区结构及开放读码框架的分析

本文分析了我国痘苗病毒天坛株基因组两端的ＨｉｎｄⅢ－Ｃ和－Ｂ片段所编码的多肽，并与其他痘苗病毒株和正痘病毒进行了比较。结果表明，天坛株基因组ＨｉｎｄＩＩ－Ｃ和－Ｂ片段共有４６个主要的开放读码框架（ＰＲＦｓ），其中一个ＯＲＦ属于痘苗病毒基因组中第一次发现的与天花病毒相似的基因编码区。此外，天坛株基因组丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅱ的编码区由于移码变异而分成两个不同ＯＲＦｓ。与其他痘苗病毒株相比，天坛株基因组有多个ＯＲＦｓ的缺失，以上现象提示，天坛株在生物学性状上与其他毒株的差异可能与此有关。

DAPK1基因开放读码序列的克隆、序列分析及诱导Raji细胞凋亡

目的 :探讨死亡相关蛋白激酶 (DAPK1)在肿瘤的形成、转移中所起作用 ,克隆DAPK1基因的开放读码序列 (ORF)。方法 :根据GenBank提供的核苷酸序列 ,自行设计引物 ,用RT -PCR从K562细胞中扩增DAPK1基因的ORF ;用质脂体将pcDNA3 1(+ ) -DAPK1转染到Raji细胞 ,Hoechst 3 3 2 58染色观察细胞凋亡 ,MTT法观察DAPK1基因对细胞生存的影响。结果 :DAPK1基因的ORF克隆到质粒pMD18-T ,测序鉴定 ;分析结果显示 ,从K562细胞成功扩增 43 0 0bp的DAPK1基因ORF有 7处突变 ,其中 6处是同义突变 ,1处是基因的单链核苷酸多态性 ;DAPK1基因的ORF克隆到真核表达载体pcDNA3 1(+ ) ,转化到Raji细胞 ;转染 48h后 ,可以检测到DAPK1的表达 ,并可以观察到细胞发生凋亡。结论 :大片段的基因可以采用RT -PCR法直接克隆 ,采用常规的转染技术可以将大片段基因转染到宿主细胞 ;成功克隆具有活性功能DAPK1基因ORF 。

乙型肝炎病毒开放读码框的结构及功能研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒的一种,其基因组至少含有4个开放读码框,分别为编码外膜蛋白的S基因区、编码核衣壳蛋白的C基因区、编码P蛋白的P基因区及编码X蛋白的X基因区。此外,还发现了两个新的区域,前-前-S区和前-X区。各结构区在病毒的复制、感染、致癌等方面发挥重要作用,文章就其结构和功能的研究进展作一综述。

半滑舌鳎GAPDH基因开放读码框的克隆及序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)广泛存在于真核生物中,对许多生理活动具有重要作用。参考金头鲷和斑马鱼的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因序列设计一对简并引物,提取半滑舌鳎肌肉组织总RNA,采用RT-PCR技术对GAPDH基因进行克隆测序及序列分析。结果表明,从半滑舌鳎肌肉组织中成功克隆了GAPDH基因的开放读码框(ORF),序列全长1 002 bp,编码333个氨基酸,分子量为36.0235 ku,等电点PI为7.75。序列同源性分析显示,该序列与其他鱼类的GAPDH氨基酸序列具有较高的同源性。

戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白抑制肿瘤坏死因子-α介导肝细胞p65的核转移

目的:研究Ⅰ型和Ⅳ型戊型肝炎病毒(HEV)开放读码框3蛋白(ORF3)对肝细胞系L02核因子-kap-pa B(Nuclear Factor kappa B,NF-κB)通路的影响。方法:分别用未转染质粒、转染Ⅰ型和Ⅳ型ORF3真核表达质粒及空载质粒的L02细胞,48小时后加入TNF(肿瘤坏死因子)-α刺激,采用免疫荧光观察细胞内p65的核转运,并用western blot检测p65蛋白的表达。结果:未转染质粒的L02细胞加入TNF-α刺激后,p65由胞浆转入胞核;转染空载的L02细胞加入TNF-α刺激后,与未转染的L02相似,p65由胞浆转入胞核;表达Ⅰ型和Ⅳ型ORF3蛋白的细胞,加入TNF-α刺激后,p65未见明显核转移。结论:Ⅰ型和Ⅳ型ORF3蛋白可抑制TNF-α介导的p65核转移。

人类疱疹病毒7开放读码框U41功能的初步探讨

应用免疫荧光检测U41蛋白的细胞内定位,RT-PCR检测U41RNA的表达时相,DNA结合试验检测U41蛋白对单、双链DNA的不同结合能力,对人类疱疹病毒7(humanherpesvirus7,HHV-7)U41的部分功能进行分析鉴定。免疫荧光检测显示,无论在HHV-7感染细胞或HHV-7U41转染细胞,U41蛋白都是仅在其胞核中呈弥漫性分布。在分别加入环己酰亚胺(cycloheximide)和磷甲酸(phosphonoformicacid)作为蛋白合成和核酸合成抑制剂的感染细胞中,U41的表达时相检测结果显示,U41蛋白在HHV-7感染细胞中是一早期表达蛋白。通过DNA结合试验发现,U41蛋白能结合单链DNA而不能结合双链DNA。提示U41的主要功能是保持DNA模板的合适构型,以便DNA的延伸和病毒DNA的合成。

白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因开放读框的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因的开放读框中编码1MSSVKY6的序列和编码492NEIVR496的序列分别设计上、下游引物,以白念珠菌ATCC11006的基因组DNA为模板进行PCR扩增;将PCR产物克隆并做序列分析后,在大肠杆菌中进行表达。结果表明PCR获得大小约为1.5kb的产物,测序分析表明克隆的产物大小为1491bp,正是白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因的开放读框,表达得到约为80kDa大小的蛋白,与理论计算一致。本研究为开展特比萘芬与其作用靶酶关系的研究奠定了基础。

戊型肝炎病毒开放读框2的克隆及表达载体的构建

戊型肝炎病毒 (HEV)为单股正链RNA病毒 ,整个基因组有 3个开放性阅读框架 (ORF) ,ORF2 (全长约 1.98kb)是主要结构基因编码区。将经过PCR获得的ORF2基因插入非分泌型酵母穿梭质粒pPIC3,构成受醇氧化酶(AOX2 )的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒 ,重组质粒经酶切线性化后转化入酵母细胞GS115 ,经过鉴定可挑取与酵母染色体发生交换的重组体 。

基于开放读码框架的GEP遗传算子

基因表达式编程(GEP)采用的已有单点重组、两点重组、插串等遗传操作有很大概率发生在基因的非编码区,导致搜索过程中遗传操作前后的基因解码成相同的表达式树,这在一定程度上影响了GEP的搜索性能。为解决这一问题,提出了一类基于开放读码框架的遗传算子,这类算子从基因的编码区中选取作用点,以保证遗传操作将改变编码区中的基因片段,从而使遗传操作后的基因能解码成不同的表达式树。实验结果表明,与已有的同类遗传算子相比,提出的遗传算子缩短了GEP算法进化代数,提高了算法的成功率。

羊草(Leymus chinensis)psbD基因开放读码框(ORF)的克隆及序列分析

从羊草中提取总RNA,采用简并PCR方法,扩增出编码353个氨基酸的psbD基因开放读码框(Open read ing frame,ORF)cDNA序列,GenBank登陆号为FJ176573,并对其序列进行了分析.同时次基因组DNA为模板对psbD基因开放读码框区域进行了扩增,证明该基因无内含子,为其功能的进一步研究提供基因材料和理论依据.

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体开放读码框3对Vero细胞凋亡的影响

目的研究单纯疱疹病毒2型（HSV-2）潜伏相关转录体（LAT）开放读码框3（ORF3）对顺铂诱导的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）凋亡的影响。方法构建重组质粒pEGPF—ORF3，并转染Vero细胞，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）验证目的基因的表达。顺铂诱导Vero细胞凋亡，通过荧光显微镜观察凋亡小体，Giemsa染色检测细胞核形态，噻唑蓝法（MTr法）检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。实验结果采用SPSSl3．0进行分析，各组间两两比较采用单因素方差分析和t检验。结果成功克隆HSV-2333株ORF3基因，构建pEGFP—ORF3真核表达载体，RT—PCR验证该真核表达载体能在Vero细胞中高效表达。转染pEGFP—ORF3的Vero细胞经顺铂诱导凋亡后Giemsa染色，显示胞核蓝染，胞质淡浅，细胞形态正常。M．rr法分析显示，细胞增殖在转染pEGFP—ORF3组（2．56±0．21）与未经任何处理的正常对照组（2．66±0．13）比较，差异无统计学意义（P〉0．05），但高于顺铂诱导凋亡的正常对照组（1．65±0．11）和pEGFP—C2组（1．56±0．18），差异均有统计学意义（P〈0．05）；流式细胞仪分析细胞凋亡率，转染pEGFP—ORF3组（4．03％±1．04％）与正常对照组（2．13％±0．09％）比较，差异无统计学意义（P〉0．05），但低于空质粒pEGFP—C2组（19．45％±2．05％），且差异有统计学意义（P〈0．05）。结论HSV-2LATORF3在Vero细胞中具有抗顺铂诱导的凋亡作用。

X染色体开放读码框架6在邻苯二甲酸二丁酯致雄性大鼠尿道下裂发生中的表达

目的观察x染色体开放读码框架6（CXorf6）在邻苯二甲酸二丁酯（DBP）致大鼠尿道下裂发生中的作用。方法于妊娠14—18d（GD24～18）实验和对照组各10只孕鼠分别给予DBP800mg／（kg·d）和豆油2ml／d灌胃，GDl9剖宫产统计尿道下裂发生率，免疫印迹法和免疫组织化学法分析两组子鼠睾丸中CXorf6的表达。结果尿道下裂仅实验组发生，发生率为40．7％；CXorf6在尿道下裂组的相对表达量为0．323±0．014（n=10），对照组为0．706±0．016（n=10），差异有统计学意义（P〈0．05）；CXorf6主要定位于睾丸间质和支持细胞，尿道下裂组CXorf6着色细胞数量减少，染色强度弱于对照组。结论DBP通过干预CXorf6的表达以影响睾丸的发育及雄激素的产生而导致尿道下裂的发生。

武汉地区戊型肝炎病毒开放读码框3的基因序列分析

目的对武汉地区戊型肝炎病毒（HEV）开放读码框（ORF）3基因序列进行分析，并确定病毒基因型。方法收集103份抗-HEVIgM阳性血清，采用逆转录一巢式聚合酶链反应扩增HEVRNA两个基因片段（5020～5392nt和5347～5956nt，EF570133）；对PCR产物进行测序，并用ContigExpress将测序结果拼接（含有ORF3基因），对ORF3基因序列进行分析。结果103份抗-HEVIgM阳性血清中HEVRNA两个基因片段均扩增出来的样本为18份，18株HEVORF3基因全长均为345bp，编码114个氨基酸。各毒株间的核昔酸同源性为92．5％～99．4%，与基因I型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型HEV的核苷酸同源性分别为83．5％～86．7％、83．2％～85．2%、84．6％～87．2％、92．0％～96．5％；系统进化分析表明该18株HEV均为基因Ⅳ型。结论武汉地区HEV主要为基因Ⅳ型，ORF3基因序列可用于同源进化分析。

人乳头瘤病毒16型E_7开放读码框编码免疫反应表位的定位

用核酸外切酶Ⅲ和s1核酸酶,逐步缺失能在原核细胞中有效表达人乳瘤病毒16型E_7开放读码框的质粒P16E_7TNP1,获得了一系列DNA逐渐缩短的质粒。它们能在大肠杆菌中表达产生一组从羧基端往氨基端逐步减少的融合蛋白,用Western blot方法检测相应融合蛋白与阳性血清的免疫反应。分析实验结果,编码免疫反应表位的核酸序列于619至644之间。

上海及新疆地区猪戊型肝炎病毒开放阅读码框架2序列的克隆与分析

通过已建立的动物戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）RT-nPCR方法,检测上海地区和新疆地区猪群样品。扩增HEV开放读码框架2（open reading frame 2,ORF2）保守区,产物为507 bp。经克隆、测序,获得20株上海株、3株新疆株序列,采用分子生物学软件与47株已知HEV进行同源性、进化关系分析。结果23株序列从同源性比对和进化关系分析均属HEVⅣ型,上海株间507 bp的核苷酸同源性为94.1%~100.0%,与上海猪源（DQ450072）、日本人源Japan1（AB369690）亲缘关系近;3株新疆株507 bp间的核苷酸同源性为86.1%~98.2%,与新疆猪源China SW1（AY594199）、中国人源T1株（AJ272108）亲缘关系近;上海株与新疆株间的核苷酸同源性为82.6%~100.0%,提示上海株与新疆株间存在差异。23株HEV在时间和地域关系分析,提示不同年份的新疆株存在差异,同年份不同猪场的新疆株进化关系存在差异,不同年份、不同区县的上海株进化关系也存在差异。

单纯疱疹病毒2型潜伏感染激活模型的建立及潜伏相关转录子开放读码框架抑制后对潜伏相关转录子基因表达的影响

目的 研究单纯疱疹病毒2型（HSV-2）潜伏感染激活中潜伏相关转录子（LAT）开放读码框架（ORF）抑制后对LAT基因表达的影响。方法 建立HSV-2潜伏感染复发的神经细胞（SHSY5Y）模型。运用相差显微镜观察HSV-2潜伏及激活后SH-SY5Y细胞形态的变化。对病毒在细胞中的潜伏及激发进行PCR验证并测序。设计3对siRNA，激活诱导后转染SH-SYSY细胞，相差显微镜观察细胞形态变化，RT-PCR半定量检测转染前后LAT ORF表达的改变。结果在存在60 μmol/L阿昔洛韦（ACV）的环境，HSV-2在SH-SY5Y细胞中建立潜伏状态。病毒在SH-SY5Y细胞中最长可潜伏14d。43℃ 1.5 h诱导病毒潜伏激发，而相差显微镜观察发现，病毒激发后细胞病变从24h到72 h，细胞变性、坏死的程度、数量随感染时间延长而增加。HSV-2 LAT、糖蛋白G（gG）基因PCR扩增及电泳结果证实病毒在细胞中的潜伏及激活。LAT ORF-siRNA转染细胞后，LAT ORF mRNA的表达水平在转染后24、36和48 h分别减少了39％、51％和60％。结论 抑制LAT ORF后能够抑制HSV-2 LAT基因的表达，为进一步研究LAT ORF在病毒潜伏感染复发中的作用提供了依据。

感染人类的Borna病毒第二开放读码框架的核苷酸序列及其变异

对经套式逆转录－聚合酶链反应（ｎｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ）证实周围血单核细胞（ＰＢＭＣ）中存在Ｂｏｒｎａ病毒（ＢＤＶ）第二开放读码框架（ＯＲＦⅡ）基因片段的５例精神病人和３例健康献血者共４０个样品进行测序，并与ＢＤＶ／ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙｃａｎｎｉｎｅｋｉｄｎｅｙ）标准病毒株比较。结果发现，所有样品在１１个核苷酸位点与文献报道的ＨＥ８０－１病毒株比较有点变异，但来源于人类的样品与ＢＤＶ／ＭＤＣＫ株之间无差异。２例情感障碍病人的１０个样品在１７０１位点处出现Ｔ→Ｃ的转换，３例健康献血者的１５个样品在１６９６位点处出现Ａ→Ｔ的转换。

鸭乙型肝炎病毒X样开放读码框架及其表达蛋白

随着鸭乙型肝炎模型越来越广泛地应用于嗜肝病毒的生命周期、慢性乙型肝炎病毒感染的规律和抗病毒药物筛选等研究,鸭乙型肝炎病毒也得到了更深入的认识,尤其是在鸭乙型肝炎病毒的基因结构上。目前已经知道鸭乙型肝炎病毒在跟哺乳动物嗜肝DNA病毒X基因相似的区域存在X样开放读码框架,也可以表达一种跟X蛋白功能相近的X样蛋白。本文就X样开放读码框架和X样蛋白的发现过程,X样蛋白的组织学定位,以及X样蛋白功能的研究进展作一综述。

单纯疱疹病毒Ⅰ型新开放读码框UL57的鉴定

单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)潜伏感染期间LATs的活跃转录可能与其启动子与增强子两侧的CTCF结合序列有关。本研究对位于UL56下游与LAT启动子上游之间并与CTCF结合序列重叠存在的一个新开放读码框(本研究中命名为UL57)进行了鉴定。首先利用HSV-1(F)细菌人工染色体(HSV-BAC)系统构建重组病毒HSV-EGFP-UL57,将EGFP序列插入UL57 5’端;然后分别通过Northern Blot和Western Blot检测EGFP标记的UL57的转录和表达;同时构建敲除UL57的重组病毒HSV-ΔUL57,观察UL57对病毒增殖的影响。结果显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57感染HEp-2细胞17h后,EGFP探针检测到两条转录产物,其中1.8kb转录产物与预测大小相符;使用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻断病毒即刻早期蛋白/早期蛋白合成后,UL57转录受到明显抑制。重组病毒HSV-EGFP-UL57感染Vero细胞后,9h可见融合蛋白表达,24h表达明显;融合蛋白分子量与预测大小(58kD)一致。病毒生长曲线显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57及HSV-ΔUL57在Vero细胞中的增殖水平与HSV-1(F)基本一致。本研究表明,在HSV-1基因组(GenBank:GU734771.1)UL56下游与LAT启动子上游之间存在一个新开放读码框UL57(116 921bp～117 799bp),UL57可以进行转录,且其转录受病毒即刻早期蛋白/早期蛋白调控;转录产物可以翻译出融合蛋白,但表达水平较低。删除UL57对病毒增殖无明显影响。

基于开放式读写平台的出版新形态研究——以“简书”APP为例

随着新媒体技术的迅速发展,人们的信息获取与使用习惯逐渐改变,在数字化读写方式上的表现尤为突出。笔者以"简书"APP为案例,对读写产品背后所体现的开放式读写平台进行多维度分析。"简书"通过网络传播与人际传播的融合,在一定程度上开创了内容生产的新模式、信息传播的新思路、文本阅读的新特征,建构了以平台用户为中心的新型出版形态。以这类开放式读写平台为依托,专业化媒介机构及职业媒体人的权力被分散和转移。但是,这类开放式读写平台也有一定的潜在问题。