戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白抑制肿瘤坏死因子-α介导肝细胞p65的核转移

目的:研究Ⅰ型和Ⅳ型戊型肝炎病毒(HEV)开放读码框3蛋白(ORF3)对肝细胞系L02核因子-kap-pa B(Nuclear Factor kappa B,NF-κB)通路的影响。方法:分别用未转染质粒、转染Ⅰ型和Ⅳ型ORF3真核表达质粒及空载质粒的L02细胞,48小时后加入TNF(肿瘤坏死因子)-α刺激,采用免疫荧光观察细胞内p65的核转运,并用western blot检测p65蛋白的表达。结果:未转染质粒的L02细胞加入TNF-α刺激后,p65由胞浆转入胞核;转染空载的L02细胞加入TNF-α刺激后,与未转染的L02相似,p65由胞浆转入胞核;表达Ⅰ型和Ⅳ型ORF3蛋白的细胞,加入TNF-α刺激后,p65未见明显核转移。结论:Ⅰ型和Ⅳ型ORF3蛋白可抑制TNF-α介导的p65核转移。

武汉地区戊型肝炎病毒开放读码框3的基因序列分析

目的对武汉地区戊型肝炎病毒（HEV）开放读码框（ORF）3基因序列进行分析，并确定病毒基因型。方法收集103份抗-HEVIgM阳性血清，采用逆转录一巢式聚合酶链反应扩增HEVRNA两个基因片段（5020～5392nt和5347～5956nt，EF570133）；对PCR产物进行测序，并用ContigExpress将测序结果拼接（含有ORF3基因），对ORF3基因序列进行分析。结果103份抗-HEVIgM阳性血清中HEVRNA两个基因片段均扩增出来的样本为18份，18株HEVORF3基因全长均为345bp，编码114个氨基酸。各毒株间的核昔酸同源性为92．5％～99．4%，与基因I型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型HEV的核苷酸同源性分别为83．5％～86．7％、83．2％～85．2%、84．6％～87．2％、92．0％～96．5％；系统进化分析表明该18株HEV均为基因Ⅳ型。结论武汉地区HEV主要为基因Ⅳ型，ORF3基因序列可用于同源进化分析。

武汉地区基因Ⅳ型戊型肝炎病毒ORF3基因变异的检测和分析

目的检测并分析武汉地区基因Ⅳ型戊型肝炎（HEV）病毒开放读码框3（ORF3）基因变异情况。方法采用逆转录-巢式聚合酶链反应（RT-nPCR）扩增41株基因Ⅳ型HEVRNA两个基因片段（nt5020～nt5392和nt5347～nt5956；参考病毒株：EF570133），并对PCR产物进行测序，然后使用ContigExpress将测序结果拼接（含有HEVORF3全序列），使用MegAlign（DNAStar软件包）对ORF3进行比对，查看ORF3基因及其编码蛋白变异情况。结果41株基因Ⅳ型HEVRNA两个基因片段均扩增出来的毒株为18株，18株HEVORF3检测出47个位点存在核苷酸替换，其中21个替换发生在密码子第1、2位核苷酸，26个替换发生在密码子第3位核苷酸；其编码蛋白存在19个位点氨基酸变异。结论武汉地区基因Ⅳ型HEVORF3存在多个位点核苷酸替换，这些位点变异在急性戊型肝炎病情进展中有何意义，有待于进一步研究。

基因1型戊型肝炎病毒 ORF3对人外周血来源的树突状细胞成熟和活化功能的影响

目的:探讨基因1型戊型肝炎病毒(HEV)开放读码框3(ORF3)对人外周血来源的树突状细胞(DC)成熟和活化功能的影响。方法:抽取健康志愿者的外周血分离单个核细胞,经体外培养、诱导为DC。然后分别用含有ORF3的慢病毒载体以及空载载体感染DC 48h,流式细胞仪检测ORF3组、空载组和空白组细胞表面CD_(80)、CD_(83)、CD_(86)的表达,ELISA法检测DC上清中IFN-β、IL-4、IL-10和IL-12的分泌。之后再加入TNF-α进一步刺激DC成熟,流式细胞仪检测各组细胞CD_(80)、CD_(83)、CD_(86)以及IFN-β、IL-4、IL-10、IL-12的表达。最后将DC与T淋巴细胞共培养,CCK8法检测T淋巴细胞增殖。结果:含有ORF3组的DC与空载组相比,加入TNF前后,其细胞表面CD_(80)、CD_(83)、CD_(86)以及细胞上清中IFN-β、IL-4、IL-10和IL-12的表达都明显较低(P<0.05)。ORF3组与空载组相比其刺激T细胞增殖的能力也较弱(P<0.05)。结论:基因1型HEV ORF3可以抑制人外周血来源DC的成熟,抑制其分泌IFN-β、IL-4、IL-10和IL-12等细胞因子,抑制DC对T淋巴细胞的增殖刺激作用,从而削弱机体对HEV的免疫反应,实现免疫逃逸,可能是导致戊型肝炎慢性化的原因之一。