异常剪接组织因子在急性髓系白血病细胞株中的表达研究

急性白血病的出凝血异常和组织因子(tissue factor,TF)的高表达有关。循环血流中的TF主要表达于细胞、微粒(microparticle,MP)和异常剪接TF(alternatively spliced human tissue factor,asHTF)中。为探究asHTF在急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)出凝血异常中的作用,本研究选用了6种常见的AML细胞株NB4、HL-60、Kasumi-1、U937、K562和THP-1,在RNA水平进行了RT-PCR检测。结果发现,在6种细胞株中仅NB4、U937细胞存在全长TF和asHTF的RNA水平基线表达并经测序验证,对上述2种细胞在蛋白质水平进行了流式细胞仪及TF活性、抗原检测发现,asHTF仅有极少量TF抗原表达且基本无TF活性,而MP相关TF(microparticle associated tissue factor,MP-TF)的抗原和活性显著高于asHTF。结论:在NB4、U937细胞中asHTF基本无促凝作用,而MP-TF有凝血活性且在肿瘤细胞释放TF中占主导地位。

肺癌细胞株中发现一种细胞周期素A2的异常剪接体

目的检测细胞周期素(cyclinA1和cyclinA2)在4种肿瘤细胞中的表达,探讨其与肿瘤发生的关系。方法采用RT PCR和DNA测序技术观察cyclinA1和cyclinA2的基因表达并进行序列分析。结果cyclinA1在4种肿瘤细胞中均未检测到表达,而cyclinA2在4种肿瘤细胞中均有表达;在肺癌细胞株(LTEP a2)细胞中,发现一种cyclinA2异常的剪接体,其保留了第四内含子,而缺失了第五外显子,其序列编码蛋白质也发生了突变,只保留了5′端194氨基酸。结论细胞周期素表达与肿瘤发生有一定相关性,LTEP a2细胞中存在细胞周期素A2异常表达,其机制与作用有待进一步的研究。

KAI1基因异常剪接与乳腺癌进展、转移的关系

目的探讨KAI1基因的异常剪接与乳腺癌进展、转移的关系。方法提取48例乳腺癌组织的RNA,利用RT-PCR技术进行逆转录扩增KAI1基因,电泳检测KAI1基因的异常剪接,测序验证,统计分析KAI1基因的异常剪接与乳腺癌进展、转移的关系。结果48例乳腺癌组织中,20例（42%）出现KAI1基因异常剪接,导致第9外显子（exon9）杂合性缺失;有淋巴结转移的乳腺癌组织中,基因异常剪接导致exon9表达缺失的频率明显高于无淋巴结转移者（P〈0.05）;Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌组织中,基因的异常剪接导致exon9表达缺失的频率明显高于Ⅰ-Ⅱ期（P〈0.05）;KAI1基因的异常剪接与乳腺癌患者的年龄、肿块大小、组织学类型以及分化程度无关（P〉0.05）。结论KAI1基因的异常剪接可能与乳腺癌的进展、转移有关,异常剪接的检测可作为预测肿瘤进展、转移的临床指标。

新的钙通道突变预示发作性共济失调患者的RNA异常剪接

Episodic ataxia type 2 (EA2) is an autosomal dominant channelopathy characterized by paroxysmal cerebellar ataxia. Previous studies suggest that most EA2 cases are associated with mutations in the α1A subunit of the P/Q-type voltage-gated calcium channel gene CACNA1A. In a UK national study, the authors analyzed 15 index cases with typical EA2 and identified two unreported intronic mutations that predict aberrant splicing.

人白血病细胞株中G_(sα)转录物的新型异常剪接

Gsα是与激活腺苷酸环化酶信号转导途径相关的蛋白质 .不同的Gsα mRNA是由不同形式的剪接或利用不同的启动子产生的 .报道人白血病细胞株中Gsα转录物的一种新型异常剪接 .以来自Jurkat细胞株的人白血病文库cDNA及人白血病细胞株HL_6 0mRNA反转录后的cDNA第一链为模板 ,PCR扩增出Gsα基因完整编码区 (命名为GsαLeu) .DNA序列分析表明 ,GsαLeu与正常Gsα相比有 2个区域发生不改变阅读框架的缺失 ,一个位于正常Gsα第 2 3个氨基酸与第 2 49个氨基酸之间 ,另一个位于第 2 5 4个氨基酸与第 2 6 0个氨基酸之间 ,GsαLeu的这种结构提示其在白血病中起着重要的作用 .将GsαLeu完整编码区插入pGEX_2T融合蛋白表达载体的凝血酶位点下游 ,高效表达了GST/GsαLeu融合蛋白 ,表达产物经亲和层析 ,一步获得了电泳纯的GST/GsαLeu,为进一步研究GsαLeu的功能打下了基础 .

基因突变导致的mRNA异常剪接与先天性白内障

先天性白内障约1／3是遗传性的，研究发现基因突变不仅可直接改变蛋白质序列，也可导致mRNA异常剪接而致病。突变位点可以通过干扰组成性剪接位点和选择性剪接位点，影响剪接体组分及选择性剪接调节因子而导致mRNA的异常剪接。目前的研究发现，突变位点可以干扰组成性剪接位点而导致mRNA的异常剪接，进而造成先天性白内障。本文就先天性白内障与选择性剪接的关系作一综述。

鸡Lmbr1基因一种异常可变剪接的克隆和表达分析

根据人Lmbr1/C7orf2基因的一种缺失外显子4的可变剪接与Acheiropodia(ACHP)疾病的关联,本研究拟根据可变剪接在物种间的保守性,进行鸡Lmbr1这种相似可变剪接的鉴定和表达分析。设计跨越Lmbr1外显子4的引物可同时检测这2种转录产物的表达,本研究成功地从鸡的心脏组织获得了缺失外显子4的Lmbr1异常剪接(Lmbr1-β)。在白来航初生雏鸡及5～6胚龄胚的组织表达分析显示,2种转录产物均可在所检测的组织中表达,与包含外显子4的转录产物(Lmbr1-α)相比,可变剪接Lmbr1-β为一种次要表达产物,表达量较弱。对多趾的丝羽乌骨鸡和四趾的白来航鸡胚组织间2种转录产物表达进行进一步分析,在2个品种3～11胚龄(E3～E11)的胚胎发育期间均可同时检测到Lmbr1-α和Lmbr1-β的表达,Lmbr1-α为主要表达产物,Lmbr1-β为次要表达产物,Lmbr1-β表达量微弱。在2个品种的胚胎发育期间未见2种转录产物明显的表达差异。结果显示,包含外显子4的Lmbr1-α为鸡Lmbr1基因的主要转录产物,广泛而稳定地在雏鸡和发育鸡胚各组织中表达,丝羽乌骨鸡多趾表型的发育与常见转录产物Lmbr1-α和异常可变剪接Lmbr1-β的表达无直接的相关。

一个新的MPL基因异常剪接体MPL L391-V392ins12的鉴定及其在248例骨髓增殖性肿瘤患者中的筛查结果

目的 鉴定MPL L391-V392ins12异常剪接体,了解其在骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中突变发生情况.方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）联合克隆测序方法对MPL基因异常剪接体进行鉴定,采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）在248例MPN患者及200名健康正常人中筛查其突变情况.结果 发现并确认了MPL基因的一个异常剪接体MPL L391-V392ins 12,即MPL基因的外显子7和外显子8之间保留了36 bp的内含子序列,导致蛋白编码序列的氨基酸位点391与392之间插入12个氨基酸（谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸）.248例MPN患者中19例（7.66％）检出MPL L391-V392ins12突变,真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）患者的检出率分别为1.92％（1/52）、9.66％（14/145）、7.84％ （4/51）;200名正常人中未检测到MPL L391-V392ins12突变.结论 MPL L391-V392ins12是存在于MPN中的一种病理性剪接体,在PV、ET、PMF中均可发生,但多见于ET、PMF,可能是MPN发病的潜在原因之一.

异常剪接组织因子与肿瘤的关系

丝氨酸／精氨酸富集蛋白（SR）、SR蛋白激酶等参与了异常剪接组织因子（asTF）的形成，近年发现asTF在肿瘤新生血管形成和肿瘤进展、转移等病理过程中发挥着一定的作用，在临床上对其检测将具有很大的意义。

中国人群中RHAG变异对mRNA剪接影响的体外研究

目的通过mRNA异常剪接体外验证实验,即体外微基因剪接系统(minigene splicing assay,MSA),研究中国人群中发现的RHAG突变对于RHAG基因mRNA剪接的影响。方法通过对KMxD数据库中RHAG基因数据的分析,选择10种中国人群中分布频率相对较高的位于RHAG基因剪接位点附近的突变或编码区域的同义突变,构建相应的RHAG外显子野生型及突变型pSplicePOLR2G微基因表达质粒。转染HEK-293T细胞,48 h后收集细胞提取总RNA,反转录后进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳检测和毛细管电泳检测,根据实验结果判断RHAG基因突变是否会影响相应外显子的正常剪接。结果2种RHAG基因剪接位点附近突变(c.158-5delT,c.807+3A>C)轻微减弱了原剪接位点的剪接效率,其余8种突变(c.312G>A,c.341+3G>A,c.609C>T,c.681G>A,c.861G>A,c.957T>A,c.984T>C和c.1139-7G>A)均不影响RHAG基因mRNA的剪接。结论RHAG基因在剪接方面比较保守,剪接位点附近突变及编码区同义突变较少会引起RHAG基因异常剪接。

糖原贮积症Ⅸ型患儿PHKA2基因新变异导致的剪切异常

目的糖原贮积症Ⅸ型(GSD-Ⅸ)是一种罕见的磷酸肌酸化激酶缺乏导致的原发性糖代谢异常,由一系列基因致病性变异引起。现对1例肝大患儿进行临床特征总结、基因分析、变异功能验证,明确其致病原因。方法收集1例GSD-Ⅸ患儿的临床资料,采集患儿及其父母外周血提取基因组DNA,应用二代测序对患者进行基因诊断,对疑似变异进行Sanger测序验证并行生物信息学分析,应用RT-PCR和一代测序对可疑剪接变异进行体内功能验证。结果患儿表现为肝大、转氨酶和甘油三酯增高,肝穿刺病理检查结果提示糖原贮积症。基因测序发现患儿PHKA2基因存在c.285+2_285+5delTAGG半合子变异。Sanger测序验证提示患儿母亲为该变异杂合型,患儿父亲为野生型。HSF3.1及ESEfinder等软件预测该基因变异会影响剪接。患儿及其母亲外周血RT-PCR证实该变异会引起PHKA2基因组成型剪接时外显子3的跳跃。结论PHKA2基因半合子变异(c.285+2_285+5delTAGG)为患者的致病原因,新变异位点的检出丰富了PHKA2基因的变异谱,为该家系的遗传咨询提供了依据。

修正RNA的错误剪接提高转基因表达水平

建立了WAP基因调控序列指导的人G-CSF乳腺表达的转基因小鼠,在检测出转基因低表达的基础上,采用RT-PCR从转基因小鼠乳腺RNA中获得人G-CSF基因,序列分析表明基因缺失第4外显子。与人G-CSF基因组基因比较,缺失部分含有内含子剪接的供体和受体位点,推断G-CSF的第3和第4内含子亦缺失。重新构建了转基因注射构件,其中删除了G-CSF第3和第4内含子,用其所建立的转基因小鼠,其乳腺表达的G-CSF较修正前基因构件提高5.4倍。结果表明,RNA的异常剪接可能是转基因低表达的一个重要因素。

RNA可变剪接与肺癌的发生发展

在人类的基因组中,超过90%的基因都会经历RNA可变剪接,可变剪接贯穿生命活动的始终.RNA剪接异常与人类的疾病密切相关,其中包括癌症.作为第二大致死因素,癌症对公共健康造成了严重的危害.在每年癌症新增及死亡病例中,肺癌均位于首位.研究发现,肺癌中存在大量剪接事件异常,可变剪接参与调控肺癌的发生和发展.在肺癌中,剪接因子存在突变、异常表达等情况,这些因素驱动了肺癌的进程.此外,可变剪接在肿瘤的耐药、放疗抵抗、血管生成及代谢等方面都发挥了不可替代的作用.

癌症中的剪接因子突变

前体mRNA剪接是真核生物基因表达的关键步骤,剪接调控是一个高度复杂的过程。通过选择性剪接,单个基因能够产生多个不同功能的RNA和蛋白质亚型。RNA剪接调控具有重要的生物学功能,剪接异常是导致人类遗传疾病的主要原因之一。越来越多的研究表明,剪接异常与肿瘤发生发展及治疗紧密关联,已成为肿瘤生物学及肿瘤遗传领域的研究热点。本综述简要介绍了RNA剪接调控机制、剪接异常与癌症的关联,重点总结了癌症中高频率突变剪接因子的研究进展,并探讨了靶向RNA剪接异常的癌症治疗策略。

成骨不全胎儿2例的COL1A1与COL1A2基因变异分析

目的探讨2例成骨不全症(OI)胎儿的临床表型及遗传学特征,明确致病原因。方法收集分别在2021年6月11日和2021年10月16日就诊于潍坊医学院附属医院的2例中孕期超声诊断疑似OI胎儿的临床资料信息。采集孕妇羊水及胎儿父母、亲属外周血样品提取基因组DNA,对2例胎儿进行全外显子组测序(WES),对候选变异进行Sanger家系验证。针对可能影响pre-mRNA剪接的变异,利用minigene体外分析变异位点附近外显子的剪接方式,对变异的致病性进行判定。结果胎儿1在胎龄17^(+6)周超声显示双侧肱骨和股骨发育落后2周余,四肢长骨多发骨折、成角畸形。胎儿2在胎龄23周超声显示双侧肱骨和股骨发育分别落后1+周和4周,双侧股骨和胫腓骨弯曲。WES结果显示胎儿1的COL1A1基因第49外显子存在c.3949_3950insGGCATGT(p.N1317Rfs*114)杂合变异,该变异导致翻译提前终止,胎儿父母外周血中未检出该变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)变异评级指南,c.3949_3950insGGCATGT变异评级为致病性变异(PVS1+PS2+PM2_Supporting)。胎儿2的COL1A2基因第26内含子中存在父源的c.1557+3A>G杂合变异,剪接报告基因分析提示该变异使COL1A2基因pre-mRNA第26外显子发生跳跃,导致mRNA转录本第1504~1557位编码序列整码缺失及其编码蛋白第502~519位氨基酸缺失,根据ACMG变异评级指南,c.1557+3A>G杂合变异评级为致病性变异(PS3+PM1+PM2_Supporting+PP3+PP5)。结论COL1A1基因c.3949_3950insGGCATGT变异、COL1A2基因c.1557+3A>G变异分别可能为2例OI胎儿的遗传学原因。COL1A1基因c.3949_3950insGGCATGT的发现丰富了成骨不全致病基因变异谱。

内含子的功能

多种多样的内含子是真核生物基因组的重要组成部分,许多研究表明,内含子能作为一种调控元件调控基因表达。近年,研究还发现一些基因内含子在成熟的mRNA中保留,保留内含子的mRNA不仅在细胞的正常发育中调控基因表达,还在胁迫应答中起着重要的作用。此外,此类mRNA异常表达还是导致多种罕见疾病和肿瘤发生的根源。

PAX6基因IVS10＋1G》A新突变导致中国东北地区一先天性无虹膜家系

目的 人类配对盒基因（paired-box gene 6,PAX6）基因编码一个转录因子,其异常会导致眼部虹膜组织发育异常,产生罕见的家族性先天性无虹膜疾病.通过分子遗传学分析,确定中国东北地区一个先天性无虹膜家系PAX6基因的突变位点.方法 对一个先天性无虹膜家系所有成员进行全面的眼部检查,采集该家系的2例患者和5名健康成员和100名正常对照者的外周静脉血,提取基因组DNA,应用聚合酶链反应扩增PAX6基因的第4至13外显子,直接测序法确定致病的基因突变,用单链构像多态性方法对结果进行验证并对对照者进行筛选.结果 该家系为位于PAX6基因第10外显子和第10内含子交界处的杂合突变（IVS10＋1G＞A）,致使DNA剪接异常,使得PAX6基因的单倍剂量不足.结论 该家系先天性无虹膜是常染色体显性遗传,PAX6基因是中国东北地区先天性无虹膜的致病基因,PAX6基因在眼部发育中具有重要作用,并发现了PAX6基因一个新的突变位点.