异戊二烯合成酶(IspS)在大肠杆菌中的表达及其产异戊二烯的研究

将来源于银白杨的异戊二烯合成酶基因按照大肠杆菌密码子偏爱性进行优化,克隆到表达载体pACYCDu-et-1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白并测定其异戊二烯合成酶活性,通过摇瓶发酵实验对重组菌产异戊二烯进行进一步研究。结果显示:银白杨异戊二烯合成酶在大肠杆菌中能够高效表达,经过镍柱纯化后,电泳检测到特异性表达条带;该重组异戊二烯合成酶能够催化异戊二烯的合成,重组菌的异戊二烯产量可达到60μg/L。

异戊二烯合成酶研究进展

异戊二烯(Isoprene)的排放具有特殊的生物学功能,对大气环境具有重要影响,另外,异戊二烯也是一种具有广泛用途的化合物。在生物体内,异戊二烯是由异戊二烯合成酶(Isoprene synthase,Isps)催化烯丙基二磷酸(Dimethylallyl diphosphate,DMAPP)脱去焦磷酸(Pyrophosphate)而生成的。因此,作为异戊二烯合成过程中的关键酶,Isps在异戊二烯的自然排放和生物合成过程都发挥着重要的作用,对Isps的研究具有非常重要的意义。到目前为止,已经在多种植物中发现了该酶,研究表明,来源于不同生物的异戊二烯合成酶具有保守的结构特征和相似的生化性质。文中就Isps的最新研究进展进行综述,包括比较分析不同生物来源Isps的生化特征和结构特征,探讨催化机制,并对该酶在生物工程领域的应用进行展望。

荚膜红细菌十聚异戊二烯焦磷酸合成酶异源表达及纯化的研究

目的构建生产辅酶Q10的大肠杆菌基因工程菌并研究相关酶的表达情况。方法将荚膜红细菌(Rhodobacter capsula-tusB10)中十聚异戊二烯焦磷酸合成酶编码基因ddsA分别克隆在Lac,T7和Trc启动子下游,使其在Escherichia coliJM83中表达。同时利用H is-tag的表达系统,对该酶的融合表达和镍柱纯化条件进行了研究。结果产物分析发现该基因在E.coli中表达出有活性的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并使宿主产生辅酶Q10。同时,28℃培养过夜,该酶以可溶形式存在于上清液中。在150 mmol.L-1咪唑的洗涤条件下,从镍柱上解离,并可以达到电泳纯。结论大肠杆菌可以表达Rhodobacter capsula-tusB10的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并合成辅酶Q10。

基于7-异戊二烯色氨酸合成酶催化合成C-7异戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物碱

以L-色氨酸系的二酮哌嗪为底物,7-异戊二烯色氨酸合成酶催化合成异戊烯化的吲哚二酮哌嗪;采用分子对接方法分析底物与酶的亲和关系;采用MTT法测定合成的异戊烯化吲哚二酮哌嗪对3种肿瘤细胞的抑制活性;单因素法优化活性最高的异戊烯化吲哚二酮哌嗪的酶催化条件。结果表明,催化合成7个C-7异戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物碱,分子对接结果验证酶催化效率;体外抗肿瘤活性筛选出cyclo-L-7-dimethylallyl-Trp-L-Pro的活性最高,其最佳酶催化条件为:反应时间18 h,温度为35℃,pH为8.0(Tris-HCl缓冲液),添加5 mmol·L^(-1)的MgCl_(2)。

西双版纳地区三叶橡胶树异戊二烯和单萜烯排放机理初步研究

对云南省西双版纳地区三叶橡胶 (Heveabrasiliensis(H .B .K)Muell. Arg)异戊二烯和单萜烯排放的研究发现 ,三叶橡胶排放很少量的异戊二烯 (排放速率大约 0～ 1μgC·g-1h-1) ,而排放大量的单萜烯 (排放速率大约 10～ 10 0 μgC·g-1h-1)。造成这种排放特征的原因可能是橡胶树树叶叶绿体中合成异戊二烯所必需的异戊二烯合成酶 (IsopreneSynthase)缺乏所致。

FgaPT2酶催化合成C-4异戊烯基化吲哚二酮哌嗪和定向诱变增强收率

在二甲基烯丙基二磷酸存在下,通过FgaPT2酶催化合成了一系列C-4异戊烯基化吲哚二酮哌嗪,测试了其生物活性,对生物活性最高的产物,探讨了通过定点诱变提高酶合成的可行性。结果表明,FgaPT2酶催化合成了7个C-4异戊烯基化吲哚二酮哌嗪,FgaPT2对底物具有一定的选择性,环-L-色氨酸-L-酪氨酸(Ⅰe)异戊烯基化催化效果最好,产物环-L-4-二甲基烯丙基-色氨酸-L-酪氨酸(Ⅱe)收率达36.1%。C-4异戊烯基化显著提高了吲哚二酮哌嗪的生物活性,尤其是环-L-4-二甲基烯丙基-色氨酸-L-色氨酸(Ⅱf)对A549和MCF-7细胞达到50%抑制效果时抑制剂的浓度(IC_(50)值)分别为54.6和30.7μmol/L,对测试细菌和真菌的最低抑制浓度(MIC值)在0.5~4 mg/L,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性的IC_(50)值为98μmol/L。Arg-244的定点诱变表明,在19个突变体中,52.6%的FgaPT2突变体提高了Ⅱf收率,动力学参数验证了环-L-色氨酸-L-色氨酸(Ⅰf)与突变FgaPT2之间的相互作用,可以提高Ⅱf收率,其中R244M对Ⅰf的亲和力最高,Michaelis-Menten常数(K_(M))为0.14 mmol/L,转化数(k_(cat))为0.06471/s,k_(cat)/K_(M)为462.14 L/(s·mmol),产物收率最高,为36.9%±1.2%。

链霉菌辅酶Q9生物合成基因sdsA的鉴定

聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因在4个不同种的链霉菌(Streptomyces coelicolorA3(2),Streptomyces maritimus,Streptomyces mycarofaciensATCC 21454和Streptomycessp.Tü4128)中分别被克隆。测序结果显示:4个聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因均编码336个氨基酸的肽链,4条肽链之间的序列有97%的同源性。将4个不同的聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因分别导入大肠杆菌中进行异源表达,有辅酶Q9产生。将4个基因分别导入八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(IspB)缺陷的大肠杆菌KO229(ΔispB)中证明它们有替代ispB基因的功能,并且在大肠杆菌中合成辅酶Q9。

大肠杆菌生产CoQ_(10)的代谢工程研究进展

随着对CoQ生物合成途径及其调控机制的深入研究,利用代谢工程的方法定向地改良菌种,优化CoQ10的代谢途径,成为提高CoQ10发酵水平的新思路。本文总结了重组大肠杆菌生产CoQ10过程中其代谢途径及其途径修饰的研究进展,分析了生产CoQ10的代谢工程限制因素,提出了利用重组大肠杆菌生产CoQ10的代谢工程策略。