异戊烯焦磷酸刺激γδT细胞增殖及体外抗HBV作用

目的采用异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)刺激人外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMCs)中γδT细胞特异性增殖,观察其体外对HBV复制和表达的抑制作用。方法体外用IPP和rhIL-2刺激人PBMCs培养10天,流式细胞术检测培养前后γδT细胞含量;将γδT细胞与HepG2.2.15细胞按一定比例共孵育培养后,ELISA法测定上清中HBsAg,HBeAg的表达,荧光定量PCR检测HBVDNA的含量。结果采用IPP和rhIL-2刺激人PBMCs,可以使人外周血γδT细胞选择性激活和扩增,由4.34%±1.79%。增加至55.65%±6.88%。所扩增的γδT细胞,能够部分抑制HepG2.2.15细胞中HBVDNA复制和HBeAg的表达,对HB-sAg的表达没有明显抑制作用。结论采用IPP刺激PBMCs,能使γδT细胞选择性增殖,增殖的细胞能够降低HepG2.2.15细胞中HBV的复制和HBeAg表达,在乙型肝炎的过继性免疫治疗中具有潜在的临床应用价值。

自身γδT细胞治疗乙型肝炎的临床观察

目的观察γδT细胞和HepG212115细胞共培养后对其HBV复制和HBeAg表达的影响。评估用γδT细胞过继回输治疗乙型肝炎的疗效。方法在体外用异戊希焦磷酸法和IL-2激活人外周血PBMCs,细胞经10 d培养后用流式细胞术检测培养前后γδT细胞含量和Perforin、GranB、NKG2D表达量;将γδT细胞与HepG212115细胞按一定比例共孵育培养后,ELISA法测定上清中HBeAg的表达。将培养10 d的γδT细胞回输给患者;患者一个疗程接受γδT细胞总数在0.8×1010～7.0×1010。结果培养10 d时γδT细胞数为91.27%,其细胞表达的Perforin、GranB、NKG2D分别为和62.8%、72.7%和60.8%。所扩增的γδT细胞能够部分抑制HepG212115细胞中HBeAg的表达。治疗前138例HBeAg阳性者,治疗后有76例HBeAg(55.1%)转阴。总有效率为77.51%。结论γδT细胞能够降低HepG212115细胞中HBeAg表达;用自身γδT细胞过继回输治疗乙型肝炎后患者的HBeAg+HBV-DNA转阴率达74%。该治疗无毒副作用,对乙型肝炎是一种安全有效的治疗方法。

引入新型异戊二烯醇利用途径促进解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的合成

目的:微生物体内异戊二烯类化合物的前体物异戊烯焦磷酸酯的天然合成路径受到严格的代谢调控,因此限制了异戊二烯类化合物的高效生物合成,而新型异戊二烯醇利用途径独立于生物体内源性代谢路径,通过在微生物中引入IUP能够进行异戊烯焦磷酸酯的大量合成,从而促进异戊二烯类化合物的大量合成。方法:在油脂酵母解脂耶氏酵母中引入IUP,强化异戊烯焦磷酸酯生物合成,促进β-胡萝卜素的高效积累。结果:通过生物信息学的方法预测IUP中两个关键蛋白酿酒酵母来源的胆碱激酶Sc CK和拟南芥来源的异戊烯磷酸激酶At IPK,均为酸性亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,二者都具有疏松不稳定的结构特征,显著富集于磷酸类物质的合成通路中。在解脂耶氏酵母中利用同源重组技术引入外源β-胡萝卜素合成关键基因carRP和car B,强化甲羟戊酸途径的关键基因thmgR和ggs1,使工程菌株中积累2.68 mg/Lβ-胡萝卜素。通过Cre-loxP系统回收基因组上的ura标签,再将IUP进一步整合到工程菌株染色体上。当培养基中含有20 m M异戊二烯醇作为底物、碳氮比为4/3且发酵96 h后,重组解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的产量提高到410.2 mg/L,较原始工程菌的产量提高了近200倍。结论:IUP能够促进解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的高效积累,为利用IUP开展β-胡萝卜素和其他异戊二烯类化合物的高效生物合成提供新思路。