人源磷脂酶PLA2异源可溶表达纯化及酶学分析

为实现人源磷脂酶A2的原核异源可溶表达,并对其进行纯化和初步的酶学性质分析。通过检索NCBI确定人源PLA2(PLA2G10),并将其构建于载体pET28a+上,并以麦芽糖结合蛋白(MBP)为促溶标签,成功构建载体pET28a-MBP-PLA2,转化E.coli BL21(DE3)后,经PTG低温诱导表达,SDS-PAGE鉴定后,确认其在上清中大量表达。根据蛋白的性质建立了一整套蛋白纯化工艺,包括Q柱洗脱,硫酸铵盐析,Phenyl柱纯化,Amylose柱纯化,分离纯化获得重组酶,SDS-PAGE测定该酶纯度大于90%。以卵磷脂为底物,酸碱滴定法测定其比活为127.04 U/mg,纯化得率48.8%,纯化倍数为10.3倍。酶学性质研究表明,该酶的分子量为56.5 kDa,最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,是钙离子依赖酶,对PC亲和能力最强,Km值为12.2 mmol/L,V(max)为0.19 mmol/L/min。本试验建立的磷脂酶A2的异源表达、纯化体系,为其进一步的理论和工业研究奠定了基础。

重组人汗腺抗菌素蛋白的异源可溶表达、发酵优化及分离纯化研究

目的:实现人汗腺抗菌素(Dermcidins,DCD-1L)的原核异源可溶表达,并进行纯化及活性分析。方法:首先检索NCBI确定人DCD-1L的序列,构建载体并转化E.coli ER2566,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,进行SDS-PAGE电泳进行鉴定。其次,通过单因素实验,对不同温度、转速和补料速度等发酵条件进行研究与优化,根据DCD-1L蛋白特性优化蛋白纯化工艺。最后采用质谱和牛津杯法对纯化的蛋白进行分子量和抗菌活性鉴定。结果:经SDS-PAGE凝胶检测,在上清中分子量处检测到条带,证明采用原核表达系统可实现人DCD-1L的可溶表达;通过单因素实验获得最佳DCD-1L的发酵条件为:37℃培养,转速400 r/min,开启蠕动泵以50 mL/30 min补料速度自动加入发酵罐中;研究还建立了包括超滤、Q柱洗脱和分子筛在内的一整套优化的蛋白纯化工艺,获得的产品纯度大于96%,总回收率18.4%;最后,通过牛津杯法检测,纯化的重组人DCD-1L在浓度为50μg/mL时,对表皮葡萄球菌这类革兰氏阳性菌较大肠杆菌具有更明显的抑菌活性。结论:本研究对重组人DCD-1L蛋白实现了原核可溶表达,并建立了稳定可靠的发酵、纯化工艺,并进行了初步的抗菌活性鉴定,为后续重组人DCD-1L蛋白的应用研究奠定了基础。