基因芯片快速检测结核分枝杆菌katG基因突变及其与异烟肼耐药相关性

目的了解结核分枝杆菌katG基因S315突变与异烟肼(isoniazid,INH)耐药相关性,建立快速简便的katG基因S315突变基因芯片检测方法。方法采用二倍稀释法检测123株结核分枝杆菌临床分离菌株对INH的耐药性。PCR及测序确定上述结核分枝杆菌katG基因S315位点突变率及突变类型。根据PCR及测序结果,设计Cy3荧光标记探针并制备katG基因S315位点突变检测基因芯片。基因芯片检测结果与PCR及测序结果进行对比分析。结果 123株结核分枝杆菌临床菌株中,39.0%(48/123)菌株对INH敏感,61.0%(75/123)菌株对INH耐药。结核分枝杆菌H37Rv株及所有临床菌株均能扩增出katG基因片段。75株INH耐药菌株中,69.3%(52/75)菌株katG基因出现S315位突变,其中25株突变类型为S315N(AGC→AAC)、12株为S315T(AGC→ACC)、7株为S315I(AGC→ATC)、各有3株分别为S315T(AGC→CGC)和S315R(AGC→AGA)、2株为S315G(AGC→GGC)。所制备的基因芯片对123株结核分枝杆菌katG基因S315野生型或突变型检测结果与PCR及测序结果完全一致。结论结核分枝杆菌katG基因S315突变与INH耐药密切相关。本研究中制备的基因芯片可快速、简便、准确、敏感和特异地检测结核分枝杆菌katG基因S315突变及其类型。

快速检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因mPCR—SSCP建立及应用

目的建立快速检测结核分枝杆菌异烟肼（INH）和利福平（RFP）耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变的多重聚合酶链反应-单链构象多态性（multi PCR-single strand conformational polymorphism analysis，mPCR-SSCP）方法。方法药敏试验检测134株结核分枝杆菌临床菌株对INH和RFP的耐药性。设计结核分枝杆菌INH和RFP耐药相关katG、inhA和rpoB基因PCR引物，建立mPCR-SSCP技术检测上述菌株katG、inhA和rpoB基因的突变，同时采用PCR直接测序技术（PCR—DS）检测上述基因片段突变情况，并对上述3种方法检测结果进行分析和比较。结果134株临床菌株均含有katG、inhA和rpoB基因，其中42株（31．3％）对INH耐药、45株（33．6％）对RFP耐药。mPCR-SSCP和PCR-DS检测结果显示，92株INH敏感菌株katG和inhA基因均未发生突变，检测特异性均为100％；89株RFP敏感菌株中rpoB基因分别有2株和1株检测出突变，检测特异性分别为97．8％和98．9％；42株INH耐药菌株中分别有33株和36株katG和／或inhA基因突变，检测灵敏度分别为78．6％和85．7％；45株RFP耐药菌株中rpoB基因分别有41株和43株发生突变，检测灵敏度分别为91．1％和95．6％。结论本研究建立的mPCR-SSCP能快速、简便、特异，并有一定的敏感性检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变，具有临床应用前景。