异甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

以pET-30（a）为表达载体,将来源于枯草芽孢杆菌K-6（Bacillus subtilis K-6）的异甘露聚糖酶基因（isoman K-6）在Escherichia coli BL21（DE3）中进行了表达。Isoman K-6登录号为HQ902141,基因全长为1083bp,共编码360个氨基酸,工程菌酶活为415.9U/mL,SDS-PAGE电泳表明,工程酶ISOMAN K-6分子量约为45000u,与预期分子量相符。经IDAHisBind树脂柱纯化的纯酶酶学性质研究表明,该重组酶为金属酶,Al3＋和Ba2＋对其有很强的激活作用,其最适反应温度为55℃、最适pH为6.0,且在pH4.5~7之间有着较好的稳定性,以槐豆胶为底物时,Vmax和Km分别为1.3U/mL和7.3mg/mL。

异甘露聚糖酶生产菌的诱变育种及固态发酵条件的优化

为了提高异甘露聚糖酶活性,对实验室保藏的一株分泌异甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌K-6(Bacillussubtilis K-6)进行紫外诱变育种,并优化一株正突变株的固态发酵条件。出发菌株枯草芽孢杆菌K-6的酶活力为206.0U/mL,经紫外线诱变处理后,挑选在培养基上透明水解圈较大的菌株进一步复筛,获得枯草芽孢杆菌K-6-9高产突变株,酶活力为349.3U/mL,高于出发菌株69.6%。连续5代发酵,K-6-9的酶活力范围为343.0～350.3U/mL,表明该突变菌株产酶性能稳定。以K-6-9为菌种,采用单因素试验和正交试验进行最佳固态发酵产酶条件的优化,结果表明:该突变株的固态发酵适宜发酵条件为:发酵时间72h、接种量3%、初始pH 7.5、装料量25g/250mL;培养基组成为:酵母细胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麸皮添加量40%,此优化条件下固态发酵K-6-9菌株产酶酶活力最高达601.6U/mL。

枯草芽孢杆菌紫外诱变异甘露聚糖酶基因突变的研究

异甘露聚糖酶是制备益生元甘露寡糖的关键酶。对分泌异甘露聚糖酶枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilisK-6)的紫外诱变正突变株K-6-9(Bacillus subtilis K-6-9)的诱变机理进行了研究。通过对出发菌株和正突变株的异甘露聚糖酶基因进行克隆和表达,以生物信息学的方法对异甘露聚糖酶基因序列和蛋白序列进行分析,得到突变株的突变碱基以及突变氨基酸。基因序列研究结果显示,突变体的总碱基突变频率为1.02,碱基突变类型包括碱基的颠换、转换。在检测到的11个碱基突变中,转换的频率(54.5%)是颠换频率(45.5%)的1.2倍,其中,C/T之间的转换所占比例最大,A-G和A-T也具有较高的替换频率,说明胸腺嘧啶(T)具有较高的辐射敏感。通过蛋白序列的比较分析,有2个氨基酸发生突变,由第21位保守氨基酸脯氨酸变异为非保守氨基酸丝氨酸,第23位非保守氨基酸丝氨酸变异为保守氨基酸谷氨酸。综合分析表明:保守区氨基酸与非保守区氨基酸的相互突变可能对其蛋白的正确组装及功能的发挥起重要作用。

产异甘露聚糖酶菌株的复合诱变

利用紫外线照射法、硫酸二乙酯(DES)法6、0Co-γ射线辐照法对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)SKS4进行复合诱变处理,筛选到了1株产异甘露聚糖酶的蜡样芽孢杆菌SKS4360,使其发酵液酶活从1004 U/mL提高到2026.6 U/mL,而且其酶活力表现稳定。

一株产异甘露聚糖酶菌株发酵条件的优化

[目的]确定SKS4的最佳发酵产酶条件。[方法]以SKS4为试材,通过单因素试验和正交试验对SKS4的最佳发酵条件进行了优化。[结果]在酵母多糖浓度为5.0%,氮源浓度为0.4%,培养基初始pH值为7.0,接种量为4.0%,装液量为40 ml/500 ml,培养温度为37℃时,蜡样芽孢杆菌SKS4产生的异甘露聚糖酶活力达2 185 U/ml。[结论]建立了最佳的SKS4产酶发酵条件,获得了较高的酶活。