异种脱细胞神经移植物修复坐骨神经缺损的实验研究

目的:观察异种脱细胞神经修复坐骨神经缺损的效果,探寻修复周围神经的新型移植物。方法:分别取家犬、新西兰大白兔臂丛神经及SD大鼠坐骨神经,对其适当切修使直径、长度相近,对获取的神经进行低渗-脱细胞处理,得到脱细胞神经移植物。32只大鼠均制造人为坐骨神经缺损,随机均分为4组,A组,家犬脱细胞神经移植修复;B组,兔脱细胞神经移植修复;C组,大鼠脱细胞神经移植修复;D组,未修复组。修复后进行神经运动和感觉功能的检测。结果:修复组大鼠坐骨神经功能恢复均显著优于未修复组,而各修复组间无明显差异。结论:异种脱细胞神经可取得与同种脱细胞神经修复周围神经缺损相似的效果。

异种脱细胞神经移植修复大鼠面神经缺损的实验研究

目的探讨异种脱细胞神经桥接大鼠面神经缺损后的神经再生方式。方法用脱细胞兔面神经作为移植物桥接大鼠面神经颊支2 cm缺损,以自体腓神经移植作为正常对照组。术后5周和12周,取面神经移植段中部及远端吻合口处各3mm神经组织,进行组织学检测。结果 12周时,两组中移植段分叉处远端均有再生纤维,再生纤维数在两组之间无显著性差异。结论异种脱细胞神经作为神经再生通道,其再生能力与自体神经无显著差异,可以作为自体神经移植的可选替代物。

环孢素A对异种脱细胞神经移植的影响

目的研究脱细胞异种面神经移植中环孢素A(cyclosporin A,CSA)的作用效果。方法 48只Wistar大鼠随机选择一侧作为实验侧,解剖面神经后于颊支制造1cm的神经缺损。按神经移植的种类分为4组,A组:异种面神经移植组;B组:异种面神经移植应用CSA免疫抑制组;C组:异种脱细胞神经移植组;D组:异种脱细胞神经移植应用CSA免疫抑制组。各组实验动物分别于术后5周,12周进行电生理学测试(潜伏期、运动神经传导速度),并进行光镜、电镜观察形态学变化。结果术后5周和12周时,C,D组动物在电生理指标及光镜、电镜指标上均优于A,B组,术后5周和12周,D组面神经颊支传导速度均高于其它各组。结论 1.0 cm缺损的异种脱细胞面神经移植动物实验中,应用CSA5mg/(kg.d)5周可以降低排斥反应,提高神经再生能力。

S100β基因修饰的大鼠嗅鞘细胞与脱细胞异种神经桥接体共培养体系的生物学特性研究

目的:通过观察S100β基因修饰的SD乳鼠嗅鞘细胞(OECs)在脱细胞异种神经桥接体(ANX)的黏附情况及分泌功能,研究S100β修饰的OECs与ANX共培养体系的生物学特性。方法:用表达S100β的重组慢病毒感染SD乳鼠的OECs (S100β-OECs),利用流式细胞术检测细胞的感染效率;将感染成功的细胞注入通过化学萃取法制作的ANX内,通过扫描电镜及免疫荧光染色法观察各组OECs的黏附情况及分泌功能。结果:GFPOECs及S100β-OECs的感染效率分别为(73. 10±2. 69)%和(73. 50±4. 59)%;通过扫描电镜观察到ANX内原有细胞主要结构基本完全去除,仅保留了细胞的的基膜结构,GFP-OECs及S100β-OECs在ANX内沿基膜纵轴方向聚集生长;免疫荧光染色结果发现,生长在ANX上的OECs、GFP-OECs、S100β-OECs均表达NGF、BDNF等神经营养因子,且S100β-OECs组S100β蛋白表达高于其他两组(P <0. 05)。结论:S100β-OECs可稳定的过表达S100β蛋白,在S100β-OECs与ANX共培养体系中,S100β-OECs与ANX的生物相容性良好。

脱细胞异种神经移植体复合BMSCs修复大鼠坐骨神经缺损的研究

目的:对脱细胞异种神经的生物相容性进行评价,证明应用其复合BMSCs促进神经再生和功能恢复的效果。方法:采用化学萃取法制备兔的脱细胞神经,应用扫描电镜观察其超微结构;将BMSCs种植到神经支架构建神经移植体,体外培养后观察细胞形态;用构建的异种神经移植体桥接大鼠坐骨神经缺损,术后8周,检测胫前肌湿重比率,对再生神经进行组织形态学分析;并应用免疫荧光染色检测神经内NGF的表达。结果:脱细胞异种神经较完整地保留了天然立体的施万细胞基底膜管结构,完全地移除了神经内的施万细胞、轴突和髓鞘成分;在体外培养中支持种植的BMSCs黏附和生长。神经移植术后,与单纯异种脱细胞神经移植组相比,复合BMSCs的异种神经移植体移植能使胫前肌湿重比率增加、有髓神经纤维数目、髓鞘厚度和轴突直径增加;增加再生神经内NGF的表达。结论:异种脱细胞神经移植体具备天然的立体结构,移除了施万细胞、髓鞘等抗原成分;神经支架无细胞毒性,具有良好的细胞相容性;复合BMSCs的异种神经移植体可显著地促进神经再生及功能恢复。

脱细胞异种神经桥接体联合经血源性间充质干细胞对大鼠坐骨神经缺损的影响

目的:研究脱细胞异种神经桥接体(ANX)联合经血源性间充质干细胞(MenSCs)对大鼠坐骨神经缺损的影响。方法:将SD大鼠随机分为自体移植组、单纯ANX组和ANX+MenSCs共培养组,制备SD大鼠右侧坐骨神经缺损模型,将不同组的桥接体移植到SD大鼠右侧坐骨神经缺损处,移植术后8周,用热板实验检测大鼠感觉功能的恢复,斜坡实验来检测运动功能的恢复,通过坐骨神经功能指数(SFI)检测大鼠坐骨神经功能,通过胫骨前肌湿重比率检测神经肌肉的功能,用透射电镜来观察髓鞘的恢复情况。结果:扫描电镜显示ANX组内原有的细胞及结构基本去除,完整保留了神经的基膜及外膜,ANX+MenSCs组可见圆形的细胞在基膜间稳定黏附生长;免疫荧光染色显示神经生长因子(NGF)在ANX+MenSCs共培养组中有阳性表达;移植术后8周,ANX+MenSCs组的患肢回缩时间显著短于单纯ANX组(P<0.05),爬坡坡度、SFI值以及胫骨前肌湿重比率均显著高于单纯ANX组(P<0.05),ANX+MenSCs组与自体组相比,两组的患肢回缩时间、爬坡坡度以及胫骨前肌湿重比均无显著差异(P>0.05),但自体组的SFI值显著增高(P<0.05);透射电镜显示与单纯ANX组相比,ANX+MenSCs组和自体组的髓鞘结构更完整,虽有水肿,但形状小而均匀致密。结论:ANX联合MenSCs修复SD大鼠坐骨神经缺损的效果良好,MenSCs可能成为外周神经系统疾病细胞治疗的潜在候选种子细胞。

复合脂肪来源干细胞的脱细胞异种神经联合富血小板血浆修复兔面神经损伤的实验研究

目的探讨复合脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的脱细胞异种神经联合富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)修复兔面神经损伤的早期效果。方法取15只3月龄雌性SD大鼠双侧坐骨神经进行脱细胞处理,作为异种神经移植体。取成年新西兰大耳白兔颈背部脂肪垫,采用Ⅰ型胶原酶单独消化法分离培养ADSCs;兔耳静脉采血后经两步离心法提取PRP;观察不同体积分数PRP对ADSCs增殖的影响,以及诱导其为类雪旺细胞可行性。取第3代ADSCs,CM-Dil活细胞染色剂标记后,荧光显微镜观察细胞标记及传代后荧光衰减情况。另取32只新西兰大耳白兔建立左侧面神经1 cm长缺损模型,随机分成4组(n=8),A、B、C、D组分别采用CM-Dil-ADSCs复合脱细胞异种神经+自体PRP、CM-Dil-ADSCs复合脱细胞异种神经、脱细胞异种神经、自体神经移植修复神经缺损。术后1、8周静态下测量各组动物左侧上唇与面正中线成角(θ角);4、8周神经电生理检测记录神经传导速度;8周荧光显微镜观察A、B组再生神经远近端CM-Dil-ADSCs数量,各组再生神经甲苯胺蓝染色计数有髓神经纤维、透射电镜观察再生神经纤维结构。结果 5%~20%PRP均能促进ADSCs增殖,经20%PRP诱导后细胞S-100免疫荧光染色呈阳性。ADSCs经CM-Dil标记后荧光显微镜下观察示细胞标记率达90%以上,被标记细胞传代后细胞增殖良好,传代后荧光稍衰减。术后各组动物均存活至实验完成。术后1周各组动物面部均发生不同程度功能障碍,A、B、C、D组左侧θ角分别为(53.4±2.5)、(54.0±2.6)、(53.7±2.4)、(53.0±2.1)°,均显著低于健侧(P<0.05);术后8周分别为(61.9±4.7)、(56.8±4.2)、(54.6±3.8)、(63.8±5.8)°,与健侧及术后1周比较差异均有统计学意义(P<0.05)。大体观察各组动物再生神经完整性及连续性均良好。术后4、8周神经电生理检测示,A、D组神经传导速度均显著快于B、C组,B组快于C组(P<0.05),A、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后8周荧光显微镜观察示,A组移植神经远、近端横断面均可见大量CM-Dil-ADSCs通过,B组通过细胞相对较少。甲苯胺蓝染色示,A、D组有髓神经纤维密度均显著高于B、C组,B组高于C组(P<0.05);A、D组间差异无统计学意义(P>0.05)。透射电镜观察示,D组有髓神经纤维鞘直径大、壁厚,形态规则;A组髓鞘形态与D组相似;B、C组髓鞘形态不规则,直径小、壁薄。结论 ADSCs可以作为种子细胞在体内存活,并可在PRP诱导下分化为类雪旺细胞,与脱细胞异种神经复合后修复兔周围神经损伤可获得较好效果。

含BMSCs的ANX移植联合G-CSF修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究

目的:探讨复合骨髓基质细胞(BMSCs)的脱细胞异种神经移植体(ANX)移植及联合应用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)修复大鼠坐骨神经缺损的效果。方法:将大鼠BMSCs种植到ANX内复合培养,制备大鼠坐骨神经10 mm缺损模型,SD大鼠随机分为4组(n=10):ANX移植组、ANX移植联合应用G-CSF组、复合BMSCs的ANX移植组和复合BMSCs的ANX移植联合应用G-CSF组。术后8周,行坐骨神经功能指数(SFI)和电生理检测;应用免疫荧光染色和实时荧光定量PCR检测再生神经内神经丝和神经营养因子的表达。结果:含BMSCs的ANX移植联合应用G-CSF组SFI、神经传导速度、再生纤维相对密度增高(P<0.05),神经营养因子表达增加(P<0.05)。结论:含BMSCs的ANX移植联合应用G-CSF可显著促进周围神经再生。