D816V突变型KIT特异性诱导COS-1非洲绿猴肾细胞核不均一核糖核蛋白 L(HNRNPL)和HNRNPK磷酸化

目的探究Ⅲ类酪氨酸激酶受体KIT D816V突变对核不均一核糖核蛋白L(HNRNPL)和HNRNPK的调控作用。方法在COS-1非洲绿猴肾细胞表达野生型KIT或KIT D816V,或与HNRNPL或HNRNPK共表达,用免疫沉淀法和Western blot法检测KIT活化及HNRNPL、HNRNPK的磷酸化,通过激光共聚焦显微镜检测KIT、HNRNPL、HNRNPK在COS-1细胞中的定位。结果野生型KIT需要其配基干细胞因子(SCF)的刺激发生活化,而KIT D816V无需SCF刺激即可发生自活化。此外,KIT D816V可诱导HNRNPL和HNRNPK发生磷酸化,而野生型KIT无此功能。HNRNPL和HNRNPK在细胞核表达,野生型KIT在细胞膜和细胞质表达,而KIT D816V主要表达于细胞质。结论野生型KIT活化需要其配体SCF参与,而KIT D816V无需SCF刺激即可发生自活化,并能特异性诱导HNRNPL和HNRNPK磷酸化。

异质性胞核核糖核蛋白A2在类风湿关节炎诊断中的临床意义

目的探讨异质性胞核核糖核蛋白A2(hnRNP A2)在类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)诊断中的临床意义,建立简便、快捷的ELISA检测方法,并与国外Anti-RA33 Ab试剂盒的结果对比,以作为验证国内试剂盒可用性的依据。方法以高纯度的具有抗原反应性的重组hnRNP A2蛋白作为抗原,对临床上包括137例RA在内的多种结缔组织病患者的血清中的相应抗体进行ELISA检测。应用国外Anti-RA33 Ab试剂盒ELISA法检测并对比检测结果。结果hnRNP A2在RA患者中的敏感性为37.23%,特异性为85.44%,抗hnRNP A2/RA33抗体在RA患者中阳性率均明显高于其他疾病组(P<0.05)。抗hnRNP A2/RA33抗体在早期RA患者中的阳性率为43.75%。与国外Anti-RA33 Ab试剂盒检测结果比较,在各组患者中检测抗RA33抗体的阳性率无明显差别(P>0.05),且总体符合率高达86.88%。另外,该抗体与年龄、病程、晨僵时间、血沉、C反应蛋白、关节功能、X线分期、类风湿因子(RF)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗核周因子抗体(APF)及抗CCP抗体之间均无相关性(P>0.05)。结论我们初步纯化了RA33抗原,对hnRNP A2进行了基因的克隆、重组蛋白的表达和纯化,并以其为抗原,用ELISA方法检测抗hnRNP A2/RA33抗体是早期诊断RA的可靠方法。与国外Anti-RA33 Ab试剂盒的检测结果对比无明显差异,自制的抗RA33抗体试剂盒可以可靠地应用于临床检验。

异质性胞核核糖核蛋白A2/B1 hnRNP A2/B1基因克隆及其在滑膜组织中的表达

目的获得hnRNPA2/B1cDNA序列,研究其在滑膜组织中的表达水平,探讨它在类风湿滑膜炎中可能的致病作用。方法从人外周血单个核细胞中提取总RNA进行逆转录反应,经PCR扩增目的片段,将其克隆于PUC-T1质粒上,并经酶切电泳、DNA测序鉴定分析。采用免疫组化和原位杂交方法,分别利用单克隆抗体和特异的cDNA探针,检测滑膜组织中hnRNPA2/B1的含量及表达水平。结果从人外周血单个核细胞总RNA中扩增得到目的片段,并经测序证实该片段为hnRNPA2/B1的编码序列。免疫组化和原位杂交显示hnRNPA2/B1在类风湿关节炎(RA)滑膜中的表达水平整体上较骨关节炎(OA)和正常对照滑膜组高(P<0.05)。结论成功克隆hnRNPA2/B1cDNA;初步证明hnRNPA2/B1水平在RA关节局部增高,推测它可能参与了类风湿滑膜炎的发病。

异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)抗原表位在系统性硬化症中的临床研究

目的探讨异质性核糖核蛋白I(hnRNPI)的抗原表位多肽在系统性硬化症(SSc)中的临床意义,初步建立简便快捷的ELISA检测方法,为系统性硬化症的早期诊断寻找新的临床指标。方法根据已知的hnRNPI蛋白氨基酸序列,应用不同的蛋白质抗原表位图谱分析软件对其进行表位分析,经比对筛选后,化学合成hnRNPI短肽序列2个,分别命名为hnRNPI-1(I-1)及hnRNPI-2(I-2),作为抗原,对321例包括硬皮病在内的多种结缔组织病患者血清相应抗体进行ELISA检测。结果抗hnRNPI-1及抗hnRNPI-2多肽抗体在SSc组中阳性率为43.4%及47.8%,均显著高于其他疾病组(P﹤0.05),在SSc中敏感性分别为43.4%及47.8%,特异性分别为88.6%及87.6%,二者之间均无显著性差异(P﹥0.05)。除与SSc患者病程相关外,该二抗体与发病年龄、临床症状、器官受累、血沉、抗Scl-70抗体及抗着丝点抗体之间均无显著性差异(P﹥0.05)。结论I-1及I-2分别是位于hnRNPI蛋白表面的抗原表位之一,具有抗原性,其抗体对SSc的临床诊断具有较高的敏感性及特异性,且在病程早期具有更高的阳性率,有助于SSc的早期诊断。

异质性胞核核糖核蛋白与肺癌发生发展的关系

肺癌发生于支气管黏膜上皮，亦称支气管癌。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率明显升高，在男性癌症患者中，肺癌已居首位，在发达国家31％的男性癌症患者死于肺癌：女性发病率也迅速升高，25％的女性癌症患者死于肺癌，甚至超过乳腺癌。目前，对于肺癌的筛查仍然没有一种确切的方法，胸透和痰细胞学很常用，但是敏感度不高。随着基因组学和蛋白质组学研究的迅猛进展，分子靶向标记在肺癌的早期检测中起着越来越重要的作用。

异质性胞核核糖核蛋白K在肝癌组织及不同密度肝癌细胞中的表达

目的:观察异质性胞核核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNPK)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及在不同密度肝癌细胞(PLC/PRF/5)中的亚细胞定位。方法:免疫组化染色观察肝细胞癌组织中hnRNPK的表达;Western印迹检测肝癌组织(n=30)及对应癌旁组织hnRNPK蛋白表达差异;应用细胞免疫组化和Western印迹法比较不同密度肝癌细胞hnRNPK蛋白的亚细胞定位及表达。结果:肝细胞癌组织hnRNPK蛋白主要表达于细胞核。hnRNPK蛋白表达在30例的肝癌组织中有21例高于其对应的癌旁组织;20倒HBV阳性肝癌组织有16例高于其对应的癌旁组织,而10例HBV阴性肝癌组织仅有5例表达高于癌旁组织。细胞免疫组化结果表明。hnRNPK主要表达于PLC细胞核中,并且随密度(汇合率为30%、50%、90%)的上升。其表达量逐渐上升。Western印迹结果表明,不同密度(汇合率为30%、50%、70%、90%)肝癌细胞的细胞质中,hnRNPK的表达量无统计学差异;而在细胞核中,随着细胞密度的增大,hnRNPK的表达量逐渐升高。结论:肝癌组织细胞核hnRNPK表达上调,且随着肝癌细胞密度的增加。其表达会逐渐增强,HBV感染可能会促进其表达。

抗异质性胞核核糖核蛋白(hnRNP)抗体与自身免疫病的关系

抗异质性胞核核糖核蛋白(hnRNP)抗体在自身免疫性疾病的研究中具有重要意义.类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和混合型结缔组织病(MCTD)中的抗hnRNP抗体主要是针对hnRNPA/B蛋白质,其中针对3种hnRNP蛋白质A2、B1、B2(RA3复合物)的自身抗体又称抗RA33抗体,检查抗RA33抗体有助于RA的早期诊断.抗hnRNP抗体不仅是有价值的诊断指标,而且在自身免疫性疾病发病机制的研究中也具有重要意义.

人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)原核表达及初步应用

目的:克隆人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)基因并构建原核表达载体,用纯化的重组蛋白进行系统性硬化症(SSc)体外诊断应用研究。方法:从体外培养的HeLa细胞中提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hnRNP I基因,构建原核表达载体pET-30a-hnRNP I,在原核表达系统E.coliBL21(DE3)中表达重组蛋白。重组蛋白纯化后作为抗原对包括系统性硬化症(SSc)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、混合型结缔组织病(MCTD)、未分化型结缔组织病(UCTD)、类风湿性关节炎(RA)、正常对照(control)在内的血清相应抗体进行ELISA检测。结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-hnRNPI,在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为59600的重组hnRNP I蛋白,重组蛋白可以可溶蛋白和包涵体蛋白两种形式存在。hnRNP I蛋白抗体在SSc中阳性率(48.72%)明显高于其他各组(P<0.05)。结论:利用构建的原核表达载体成功表达出hnRNP I蛋白,此重组蛋白可用于SSc的临床诊断检测。

异质性胞核核糖核蛋白K与肿瘤研究的最新进展

近几十年来,癌基因和抑癌基因一直是肿瘤生物学中的一个重要分类,然而对于一些基因却很难将其归类。异质性胞核核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,HNRNPK)是一个核酸结合蛋白,参与了基因表达调控、信号转导等很多细胞进程。近些年发现HNRNPK在多种肿瘤中过表达,且其过表达与患者的预后呈负相关,提示其可能在这些肿瘤中发挥癌基因的功能。然而,在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的研究报道中发现HNRNPK可能扮演抑癌基因的角色。因此,本文对HNRNPK在肿瘤发生发展中的分子功能及作用机制的最新进展进行综述。

核不均一核糖核蛋白L在肿瘤中作用机制的研究进展

核不均一核糖核蛋白(hnRNP)家族的重要成员hnRNP L,是一类主要位于细胞核的RNA结合蛋白。近年来发现,hnRNP L除了在免疫系统形成中发挥重要作用外,还在多种肿瘤中异常表达。进一步研究发现,hnRNP L促进肿瘤细胞的各种生物学过程,包括增殖、迁移和侵袭,并与预后相关,提示其在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。本文通过总结hnRNP L在各种癌症中的作用机制,探讨hnRNP L的临床意义。

痰液异质性核核糖核蛋白A2/B1与端粒酶逆转录酶检测在肺癌诊断中的探讨

肺癌是世界范围内致死率最高的癌症,而肺癌的预后与诊断时的临床分期密切相关,因此"早期发现、早期诊断、早期治疗"是降低肺癌病死率的重要措施。肺癌高危人群痰脱落细胞中有异质性核核糖核蛋白A2/B1与端粒酶逆转录酶活性的高表达,通过联合检测是否可发现处于早期和可治疗阶段的肿瘤,从而潜在降低肺癌的病死率,因此痰液异质性核核糖核蛋白A2/B1和端粒酶逆转录酶的联合检测是对肺癌早期诊断的一个有益探索。

核糖核蛋白hnRNPK结合lncRNA调控肿瘤发生发展的研究进展

长链非编码RNA(lncRNA)参与肿瘤发生和发展过程,可作为肿瘤诊断与治疗的靶点。异质性胞核核糖核蛋白(hnRNP)家族成员hnRNPK广泛分布于多种肿瘤细胞内,具有调控基因表达、信号转导等功能。hnRNPK作为高度保守的DNA/RNA结合蛋白,可与lncRNA相互作用调控基因的转录、剪切、翻译过程,影响肿瘤的进展。因此,了解hnRNPK和lncRNA的功能及作用机制,特别是深入研究hnRNPK与lncRNA相互作用在肿瘤中的功能,可为肿瘤的临床治疗提供参考。

核内不均一核糖核蛋白A3与疾病关系的研究进展

核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)是人体内一大类的RNA结合蛋白家族,该家族可作为“RNA骨架”,参与核酸代谢的多个环节,包括可变剪接、信使核糖核酸(message RNA,mRNA)稳定以及转录和翻译调控等方面,并最终在细胞的生物学过程中发挥关键作用。与该家族中被广泛关注的成员hnRNP A1、hnRNP A2/B1相比,hnRNP A3是一个较少被研究的蛋白。本文就hnRNP A3在多种疾病中的表达情况、临床价值以及内在机制的研究进展做一综述,旨在为相关疾病的机制探讨及新型治疗靶点的挖掘提供依据。

异质核核糖核蛋白L促进肝细胞癌细胞增殖的机制研究

目的探究异质核核糖核蛋白L(HNRNPL)蛋白对原发性肝细胞癌(HCC)细胞增殖能力的影响及潜在机制。方法利用公共数据库和实时定量PCR分析HNRNPL在HCC和癌旁组织间的表达差异;利用蛋白免疫印迹、细胞计数、平板克隆和裸鼠成瘤实验检测敲减HNRNPL对HCC细胞MHCC97H、HepG2增殖和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响。结果HCC组织中HNRNPL的mRNA水平(2.76±0.37)高于正常组织(1.00±0.14),差异具有统计学意义(t=3.93,P=0.002)。平板克隆实验显示两组敲减HNRNPL表达的MHCC97H细胞集落数分别为(33.3±7.7)、(43.3±2.2),低于对照组(84.3±6.2);两组HepG2敲减细胞的集落数分别为(59.0±15.5)、(41.7±4.8),低于对照组(200.3±6.2),差异均有统计学意义(均P<0.01)。敲减HNRNPL表达降低了HCC细胞增殖能力和MAPK通路的活化水平,而过表达原癌基因c-RAF可部分缓解敲减HNRNPL的细胞增殖抑制作用,挽救HCC细胞的成瘤能力。结论HNRNPL通过激活MAPK信号通路促进HCC细胞增殖。

肾透明细胞癌组织浸润CD8+T细胞中异质性胞核核糖核蛋白A2B1的表达及其临床意义

目的探讨异质性胞核核糖核蛋白A2B1(HNRNPA2B1)在肾透明细胞癌(ccRCC)组织浸润CD8+T细胞中表达分布特征及其临床意义。方法利用基因表达综合数据库(GEO)公共数据分析HNRNPA2B1在ccRCC组织浸润免疫细胞以及CD8+T细胞亚群中的表达分布;转录组测序技术(RNA-seq)差异分析高、低表达HNRNPA2B1 ccRCC患者高变免疫基因并富集相关通路。多标记免疫荧光染色(mIHC)检测223例ccRCC患者癌组织和癌旁正常组织浸润CD8+T细胞中HNRNPA2B1的表达分布特征,采用R语言做统计分析,经单因素Cox、最优子集回归和LASSO回归交叉验证筛选临床因素并纳入多因素Cox回归构建列线图预测模型。Wilcoxon检验用于组间差异显著性分析,生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。结果HNRNPA2B1在CD8+T细胞上高表达并参与抗原加工呈递、T细胞增殖调节等多个信号通路。肾透明细胞癌患者肿瘤组织浸润HNRNPA2B1+CD8+T细胞比率高于癌旁正常组织[1.26%(0%,35.56%)比0.28%(0%,13.35%),4.5,U=6287,P<0.01]。肿瘤组织低浸润HNRNPA2B1+CD8+T细胞患者总体生存期(OS)显著差于高浸润患者[风险比(HR)=0.41;95%可信区间(CI):0.16~1.07,P<0.01]。对单因素Cox、最优子集回归筛选得到的年龄、病理分级、TNM分期和HNRNPA2B1+CD8+T细胞浸润程度(P<0.05)构建列线图风险预测模型。公共单细胞数据分析结果表明HNRNPA2B1在增殖CD8+T细胞上高表达。结论肾透明细胞癌组织浸润CD8+T细胞HNRNPA2B1蛋白水平表达的降低表明其参与肾透明细胞癌的进展过程。

核不均一核糖核蛋白L对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨核不均一核糖核蛋白L(hnRNPL)对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用蛋白质免疫印迹(Western blot)和荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析正常口腔上皮细胞(HOK)和口腔鳞状细胞癌细胞系(HSC3、CAL27、SCC15、HN13)中hnRNPL蛋白和信使RNA(mRNA)表达水平;以CAL27细胞作为研究对象,采用对照短发卡RNA(shRNA)和hnRNPL shRNA慢病毒感染CAL27细胞,建立对照组和hnRNPL KD组细胞,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和EdU染色法检测两组细胞的增殖能力;采用流式细胞术分析两组细胞的凋亡水平;采用划痕实验和Transwell分析两组细胞的迁移和侵袭能力;采用Western blot和荧光定量PCR分析两组细胞p53、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)和黏着斑激酶(FAK)蛋白和mRNA表达水平。组间比较采用t检验。结果:口腔鳞状细胞癌细胞系(HSC3、CAL27、SCC15、HN13)hnRNPL蛋白表达水平(1.40±0.12、1.81±0.16、1.38±0.09、1.39±0.10)明显高于正常口腔上皮细胞(HOK,0.97±0.12),差异有统计学意义(t=6.451、10.230、6.729、6.707,P<0.05)。口腔鳞状细胞癌细胞系(HSC3、CAL27、SCC15、HN13)hnRNPL mRNA表达水平(1.47±0.13、2.04±0.22、1.59±0.10、1.42±0.08)明显高于正常口腔上皮细胞(HOK,0.99±0.05),差异有统计学意义(t=8.307、11.260、13.820、11.560,P<0.05)。对照组细胞吸光度(A)值(2.04±0.13)明显高于hnRNPL KD组细胞(1.61±0.11),差异有统计学意义(t=6.322,P<0.05)。对照组细胞EdU阳性率[(70.47±10.42)%]明显高于hnRNPL KD组[(43.71±4.54)%],差异有统计学意义(t=5.765,P<0.05)。对照组细胞凋亡率[(3.72±1.10)%]明显低于hnRNPL KD组[(11.81±2.43)%],差异有统计学意义(t=7.427,P<0.05)。对照组细胞愈合率[(86.55±4.66)%]明显高于hnRNPL KD组[(57.34±6.20)%],差异有统计学意义(t=9.224,P<0.05)。对照组细胞迁移数量[(106.50±7.66)个]明显高于hnRNPL KD组[(77.83±6.18)个],差异有统计学意义(t=7.135,P<0.05)。对照组细胞p53和bcl-2蛋白表达水平(0.69±0.08、0.80±0.08)明显低于hnRNPL KD组(1.07±0.14、1.30±0.12),差异有统计学意义(t=7.135、7.135,P<0.05)。对照组细胞FAK蛋白表达水平(1.16±0.14)明显高于hnRNPL KD组(0.66±0.07),差异有统计学意义(t=7.943,P<0.05)。结论:hnRNPL在口腔鳞状细胞癌中呈高表达,促进口腔鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭等过程。

抗异质性胞核核糖核蛋白A2/RA33抗体酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 探讨酶联免疫吸附法 (ELISA)检测抗异质性胞核核糖核蛋白A2 (hnRNPA2 ) /类风湿关节炎 (RA) 33抗体在不同风湿性疾病患者中的阳性率及对RA早期诊断的意义。方法 以纯化的重组蛋白hnRNPA2为抗原 ,用ELISA检测RA 179例、系统性红斑狼疮 (SLE) 14 1例、其他弥漫性结缔组织病 (CTD) 97例、血清阴性脊柱关节病 (SPA) 30例、骨关节炎 (OA) 10例、关节痛 /关节炎5 9例、正常对照 4 0名 ,比较抗hnRNPA2 /RA33抗体在各组人群中的阳性率 ,并评价其与RA患者临床和实验室检查指标间的关系及早期诊断的价值。结果 抗hnRNPA2 /RA33抗体在RA患者中的敏感性为 36 9%、特异性为 87 1% ,在SLE、其他CTD、SPA和OA患者中阳性率分别为 19 2 %、7 2 %、6 8%和 0。抗hnRNPA2 /RA33抗体在早期RA患者中的阳性率为 4 3 3%。结论 以纯化的重组蛋白hnRNPA2为抗原的ELISA是检测抗hnRNPA2 /RA33抗体 ,早期诊断RA的可靠方法。

异质性胞核核糖核蛋白A2基因的克隆、表达、纯化及其临床应用

目的 构建含异质性胞核核糖核蛋白A2 (hnRNPA2 )cDNA片段的基因克隆 ,制备并纯化重组蛋白hnRNPA2 ,用以检测抗hnRNPA2 RA33的抗体。方法 从人外周血单个核细胞提取细胞总RNA ,应用RT PCR方法扩增hnRNPA2cDNA ,将其克隆于pUC T1质粒中 ,测定其序列。构建高效表达载体pET2 8a hnRNPA2 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS并进行诱导表达 ,将含目的蛋白的组分经金属螯合树脂亲和层析柱进行蛋白纯化。以该纯化蛋白为包被抗原 ,ELISA方法检测类风湿关节炎 (RA) 97例、系统性红斑狼疮 (SLE) 5 0例、混合性结缔组织病 (MCTD) 8例、其他关节炎 2 9例、其他弥漫性结缔组织病 (CTD) 99例。结果 构建hnRNPA2重组表达载体并在大肠杆菌中获得hnRNPA2高效表达 ;在RA、SLE、MCTD、其他关节炎、其他CTD患者中抗hnRNPA2 RA33抗体阳性率分别为36 .8%、2 4%、75 %、3.75 %、10 .10 % ;在RA中特异性为 86 .6 7%。结论 以纯化的基因重组蛋白hnRNPA2为抗原检测hnRNPA2