流式液相蛋白定量技术测定生物医用材料产品体液免疫评价中免疫球蛋白含量

该研究采用流式液相蛋白定量技术测定生物医用材料产品体液免疫评价中免疫球蛋白含量。选用牛源异种脱细胞真皮基质为试验样品,按照高、中、低剂量组植入至Balb/C小鼠皮下至4周。4周后用流式液相多重蛋白定量技术测定IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM,将试验组与对照组的数据进行统计学分析。结果表明,与阴性对照组相比,阳性对照组中IgG3、IgA含量未见明显差异,而IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM含量显著性高于阴性对照组;样品组高、中、低剂量组均未见明显差异。结果表明该方法适用于生物医用材料产品体液免疫评价中免疫球蛋白含量分析。

基于iTRAQ技术对低级别胶质瘤与正常脑组织差异性表达蛋白的初步筛选研究

目的应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术筛选低级别胶质瘤与正常脑组织的差异表达蛋白质。方法将6例低级别胶质瘤实体组织标本与2例正常脑组织标本各自混合后提取总蛋白,进行定量分析和酶解。iTRAQ标记后进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。通过Mascot2.9软件进行相关图谱分析。结果有效鉴定出低级别胶质瘤与正常脑组织差异表达蛋白质162个,其中34个上调蛋白质,128个下调蛋白质,这些差异表达蛋白质具有多种生物学活性,参与不同的代谢以及信号通路。结论通过iTRAQ技术可有效鉴定出众多低级别胶质瘤与正常脑组织的差异表达蛋白质,为后续寻找低级别胶质瘤的生物标记物奠定基础。

流式微球捕获蛋白定量检测技术的原理与应用

流式微球捕获蛋白定量检测技术也被称为悬浮点阵技术、液态芯片技术,是基于流式检测技术和荧光微球捕获技术的液相、高通量、多重蛋白定量技术,基本原理是在荧光编码捕获微球表面进行的荧光标记液相抗原抗体反应,具有流式技术检测速度快、定量准确、多参数、高通量的特点,检测所需样品量小,可同时检测一个样品中数种到数十种可溶性蛋白,具有良好的可重复性,是固相酶联免疫吸附检测的一项良好的替代技术,在病毒感染、各类炎症、过敏性疾病、自身免疫病、肿瘤、移植、药物研发等相关的研究领域具有应用价值,在儿科危重病患儿的诊断和治疗、急性公共传染性疾病的研究和临床诊治中具有特殊意义。文章主要介绍流式微球捕获蛋白定量检测技术的技术原理、特点、应用与局限性。

^(18)O标记联合高效液相色谱-高分辨率质谱技术定量测定阿胶中的明胶

采用胰蛋白酶催化的^(18)O标记联合高效液相色谱-高分辨率串联质谱技术(high performance liquid chromatography-linear ion trap/Orbitrap high-resolution mass spectrometry,HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS)研究阿胶的特征性多肽的^(18)O标记情况和明胶混合物中阿胶、牛皮明胶的定量情况。结果表明,阿胶的特征性多肽均能被2个^(18)O原子标记,当^(18)O和^(16)O标记多肽以20∶1、10∶1、5∶1、1∶1和1∶5的质量比例混合时,检测到的^(18)O与^(16)O标记多肽比值分别为19.66、10.24、5.01、1.00和0.20。当阿胶和牛皮明胶质量比以1∶10、1∶1和10∶1混合,以^(18)O标记物为内标,检测到的阿胶与明胶比值分别为0.10、1.02和9.72。因此,胰蛋白酶催化的^(18)O标记联合HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS适用于阿胶产品中目标明胶的含量检测,可为阿胶产品的质量控制提供技术支撑。

高效液相色谱-质谱联用技术在蛋白质检测中的应用

随着科学的进步,质谱从一种用来分析有机化合物的分子量和结构的强有力工具发展成了可以应用于生物大分子分析的必不可少的技术。近些年来,将具有强大分离能力的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)发展迅猛,有着高灵敏度、高分辨率、专属性强等优点,在食品分析、药品分析、生物样品等中有着广泛的应用。本文对高效液相色谱-质谱联用技术在蛋白质组学方面与蛋白质的定性定量分析方面进行了综述。

iTRAQ技术及其在蛋白质组学中的应用

近年来随着蛋白质组学的迅速发展,其相应的方法学研究也取得了巨大的进步,一系列新技术融入了蛋白质组学研究中,极大地促进了这门学科的发展.相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术与高度敏感性和准确性的串联质谱及多维液相色谱联用技术已成为蛋白质定性和定量研究的主要工具之一.该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性.由于其能够同时对多达8种样品进行标记分析,故在生命科学的各个领域得到了广泛的应用.本文对iTRAQ的原理、实验流程、优缺点及近几年的应用进展进行综述.

iTRAQ技术及其在动物蛋白质组学中的研究进展

同位素的相对与绝对定量(iTRAQ)是一种全新且功能强大的蛋白质组学定量分析技术,该技术具有灵敏性高、重复性好、分析范围广和高通量等优点,其与多维液相色谱和串联质谱相结合,已经成为蛋白质组学定量研究的主要手段之一。近年来,iTRAQ技术在不断优化的同时,也已经在动植物、微生物等领域,以及在寻找蛋白质标记物、多时间点蛋白动态监测等方面被广泛应用。文章介绍了i TRAQ技术的基本原理、流程,并对i TRAQ技术在畜禽及模式动物蛋白质组学领域的研究进展进行了综述。

基于质谱进行低丰度靶向蛋白质定量的实验教学设计

质谱的多重反应监测(MRM)是蛋白质组学研究的常用技术,本文拟尝试基于质谱的低丰度靶向蛋白质定量检测,探索将此技术应用到教学实验中.课程以胰蛋白酶酶解的牛血清白蛋白为样品,涵盖了方法建立、色谱分离、质谱鉴定和数据分析完整实验流程.使学生可以深入了解到三重四级杆质谱仪的高灵敏度特性和在生命分析、医学研究中的应用.该实验融入了前沿领域的研究方法,也可用于其他蛋白质的实验教学,以开拓学生视野,提高学生的综合创新能力.

流式微珠阵列术在医学中的研究进展

随着高分子微球技术的日益创新,流式细胞术与高分子微球技术相结合的流式细胞微球芯片捕获技术也随之产生,流式细胞微球芯片捕获技术又称为流式微球分析技术、流式微球技术、流式微珠阵列术,具有检测灵敏度高、特异性强、分析速度快等优点,应用前景广阔。我们就流式细胞微球捕获芯片技术在医学中的研究进展做简要综述。

桑树硬枝扦插生根过程基部皮层的差异蛋白质组分析

应用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术结合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),分析桑树硬枝扦插生根不同阶段插穗基部皮层的蛋白质组差异,为从分子水平研究桑树扦插生根调控机制提供基础信息。在扦插初期、膨大期、发根期3个阶段的插穗基部皮层共鉴定到4 427种蛋白质,通过对同位素报告基团相对含量的定量检测,共检出2 875种蛋白质。其中,扦插初期和膨大期的差异蛋白质有595种,扦插初期和发根期的差异蛋白质有660种,膨大期和发根期的差异蛋白质有231种。从表达差异显著的蛋白质中筛选出GDP-D-甘露糖基-3’,5’-异构酶、凝集素KM+、生长素IAA水解酶、热激蛋白hsp70、丙二烯氧化物环氧酶、细胞色素b6、过氧化物酶等可能与生根过程密切相关的蛋白质,通过GO功能注释和KEGG数据库比对分析,这些差异蛋白质在扦插生根中主要执行的功能包括代谢过程、多细胞组织进程、定位系统建立、生物学调控、刺激应答、细胞要素、细胞器要素、催化活性和蛋白质结合等,并主要参与次生代谢产物的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、内质网蛋白质加工、苯丙素生物合成、糖酵解和糖异生等代谢通路。

SLE合并SONFH患者血清差异表达蛋白筛查

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)合并激素性股骨头坏死(SONFH)患者血清蛋白质组学表达差异,寻找并鉴定诊断SONFH的潜在生物学标志物。方法分别采集10例SLE合并SONFH患者(SONFH组)、5例健康者(对照组)的外周血,提取血清,去除高丰度血清蛋白质,采用同位素相对标记与绝对定量技术联合二维液相色谱-串联质谱技术进行蛋白组学分析,并进一步行GO和KEGG通路生物信息学分析,寻找并鉴定差异表达的蛋白质。结果与对照组比较,SONFH组共鉴定出16个差异表达蛋白,其中铜蓝蛋白、结合珠蛋白、IGHG1蛋白、免疫球蛋白重链1、C反应蛋白、补体C9、α1-酸性糖蛋白表达上调(P均<0.05),SERPINA4蛋白、凝溶胶蛋白、凝血因子Ⅻ、色素上皮细胞衍生因子、备解素、巯基氧化酶1、凝血因子ⅩⅢ、KRTDAP蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白3表达下调(P均<0.05)。KEGG通路分析提示以上16个蛋白与补体及凝血级联反应、系统性红斑狼疮、肌动蛋白细胞骨架调节、p53信号通路、卟啉和叶绿素代谢、FcγR-介导吞噬信号通路密切相关。结论成功从SLE合并SONFH患者血清筛选出差异表达蛋白,此16个蛋白可能是诊断SONFH的潜在生物学标志物。

超高效液相色谱-三重四级杆质谱法用于阿胶糕类食品中阿胶的鉴别及马、牛、羊、猪皮源成分的检测

目的:建立以特征肽为检测指标的阿胶糕中阿胶的鉴别方法与马皮、牛皮、羊皮、猪皮源成分的检测方法。方法:采用三氯乙酸沉淀法提取阿胶糕中的蛋白质,胰蛋白酶进行酶解处理,利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱法(UHPLCQQQ MS),电喷雾离子源(ESI),正离子模式下扫描,采用多重反应监测模式,对特征肽目标离子进行检测。结果:经验证,鉴别方法和检查方法均均有良好的专属性,灵敏度高。市售样品测定结果显示,部分样品中检出阿胶成分,有的样品中检出牛皮源成分,有的样品中未检出任何皮源性成分。结论:所建立方法操作简便,专属性强,可用于阿胶糕中阿胶的鉴别和掺假杂皮胶的检测。

基于相对和绝对定量同位素标记技术对肥胖大鼠海马区差异蛋白组学的研究

目的筛选及鉴定肥胖大鼠海马区的差异蛋白表达。方法将24只SD大鼠随机分为单纯肥胖组(Ob,n=14)及正常对照组(NC,n=10)。予高脂高糖饮食制备单纯肥胖大鼠模型,采用相对和绝对定量同位素标记技术(iTRAQ)联合二维液相色谱-串联质谱(2D-LC-MS/MS)法鉴定肥胖大鼠海马区差异蛋白表达,对所获蛋白行生物信息学分析,Western blot法对筛选的部分差异蛋白进行验证。结果成功建立单纯肥胖大鼠模型,共鉴定出310种差异蛋白表达。于KEGG数据库检索筛选出26个差异蛋白显著富集的代谢通路。选取位于蛋白功能相互作用网络交叉点的4种差异蛋白行Western blot验证,发现蛋白表达水平与质谱结果一致。结论采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,能有效筛选肥胖大鼠海马区差异蛋白表达,为研究肥胖对中枢神经系统损伤机制提供依据。

LC-MS/MS技术在蛋白质药物定量分析中的应用

近年来,蛋白质药物已经成为全球制药业的研发热点。建立灵敏、准确、高通量的蛋白质药物定量分析方法,是进行蛋白质药物研究的关键前提,也是蛋白质药物研究的难点。随着液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)的发展,其在蛋白质药物定量分析中起着越来越重要的作用。本文首先综述了蛋白质药物的分类,然后比较了LC-MS/MS技术与传统配体结合测定方法(LBA)在蛋白质药物分析中的优缺点,以及分析了LC-MS/MS技术在蛋白质药物定量分析中的常见问题、解决方法、应用方向等。最后预测,短时间内LC-MS/MS不会完全取代传统的LBA方法,随着LC-MS/MS技术和生物化学技术的充分结合,蛋白质药物分析将会得到飞速的发展。

晚期膝骨关节炎患者外周血中趋化因子表达谱的特征分析

目的探讨行关节置换术的晚期膝骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者外周血中趋化因子谱的特征及变化,了解其慢性炎症状态。方法选取2016年1—7月在第二军医大学长征医院住院的行关节置换术的晚期膝OA患者共20例,设为OA组,同期选取本院体检中心健康体检者共20例为正常对照组,通过流式液相多重蛋白定量技术,检测两组血浆中趋化因子表达谱水平。结果OA组和正常对照组血浆中,IL-8(CXCL8)、IP-10(CXCL10)、Eotaxin(CCL11)、MCP-1(CCL2)的浓度差异无统计学意义(P>0.05);OA组血浆中,TARC(CCL17)和RANTES(CCL5)的浓度明显低于正常对照组(P<0.05)。结论晚期膝OA患者外周血中趋化因子的产生趋于平稳甚至逐渐降低,而炎症反应可能更多的局限于关节局部。

急性白血病患儿外周血IL-17水平变化及意义

目的观察急性白血病患儿外周血白细胞介素-17(IL-17)的水平变化,并探讨其临床意义。方法急性白血病患儿43例,按照化疗结果分为未缓解组(15例)、缓解组(28例)及化疗后骨髓抑制组(19例)、非骨髓抑制组(24例),22例健康儿童作为对照组。采用流式液相多重蛋白定量技术(CBA)检测各组外周血血浆IL-17。结果未缓解组、缓解组、骨髓抑制组和非骨髓抑制组IL-17水平低于对照组(P均<0.05),未缓解组IL-17水平低于缓解组(P<0.05),骨髓抑制组IL-17水平低于非骨髓抑制组(P<0.05)。结论急性白血病患儿外周血IL-17水平降低,其表达水平部分反映了白血病的疾病状态。

褪黑素体内外对胃癌Th1/Th2/Th17型细胞因子表达的影响

目的探讨褪黑素(MLT)体内外对胃癌Th1/Th2/Th17型细胞因子干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17a表达的影响。方法 1.构建荷胃癌小鼠模型,共32只雄性615小鼠全部荷小鼠前胃癌(MFC)细胞后随机分为4组,分别用0、25、50、100 mg/kg剂量褪黑素进行腹腔注射并测量肿瘤长短径。干预1周后取外周血,剥离肿瘤组织进行称重和测量。2.将MFC接种于6孔细胞培养板中,贴壁24h后分别用0、2、4、6、8、10 mmol/L浓度褪黑素干预,24 h后形态学观察并收集相应上清液。3.采用ELISA检测外周血清中褪黑素的浓度变化。采用流式液相多重蛋白定量技术流式微珠阵列(CBA)分别检测外周血清、细胞上清液中Th1/Th2/Th17型相关细胞因子的浓度变化。结果 1.成功建立荷胃癌小鼠模型。与阴性对照组相比,褪黑素中、高剂量组小鼠外周血清褪黑素浓度明显升高,肿瘤体积明显下降。与阴性对照组相比,中剂量组血清中IL-10浓度明显增加;高剂量组血清IFN-γ、IL-2、IL-10浓度均明显增加。2.褪黑素干预MFC细胞实验中,与空白对照组相比,6、10 mmol/L褪黑素组中IFN-γ浓度显著降低;4、6、8、10 mmol/L褪黑素组中IL-6浓度明显降低,而6 mmol/L褪黑素组IL-10浓度明显升高。以上差异均具有统计学意义(P<0. 05)。结论褪黑素体内外对胃癌细胞均有抑制作用且可能通过调节Th1/Th2/Th17细胞相关因子IFN-γ、IL-2、IL-6及IL-10的表达起增强肿瘤免疫作用。

支气管哮喘患者外周血TH1、TH2、TH17及Treg细胞相关细胞因子的表达及意义

目的研究支气管哮喘患者T_H1、T_H2、T_H17及Treg细胞相关炎性因子的变化规律。方法采用多重蛋白定量技术(CBA法)检测支气管哮喘患者及健康对照人群血清中T_H1、T_H2、T_H17及Treg细胞相关细胞因子的蛋白质表达。结果在支气管哮喘患者血清中转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-17A的表达水平明显高于健康对照人群,且差异有统计学意义(P<0.05)。在支气管哮喘患者与健康人群血清中IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论支气管哮喘患者外周血中TGF-β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A的表达水平明显升高,推测存在TH1、TH2、TH17及Treg细胞的比列失衡。

麻风患者血清Th1/Th2/Th17相关细胞因子检测

目的:检测麻风患者血清中Th1/Th2/Th17相关细胞因子水平,探讨其在麻风发病中的作用。方法:利用微量样本多重蛋白定量技术检测12例新发麻风患者,29例治愈麻风患者及37例正常人血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ和IL-17A水平。利用Kruskal-Wallis和Nemenyi方法进行组间比较。结果:新发组患者血清IL-1和IL-2水平显著高于治愈组(P<0.005);新发组及治愈组患者血清IL-6水平均显著高于对照组(P<0.005);新发组患者血清IFN-γ和IL-17A水平显著高于对照组(P<0.005)。新发组、治愈组和对照组IL-4、IL-10和TNF浓度差异无统计学意义。结论:Th1/Th2/Th17某些相关细胞因子可能与麻风的发病有关。

iTRAQ结合2DLC-MS/MS技术筛选前列腺癌差异表达蛋白

目的应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)结合二维液相色谱-串联质谱技术(2DLC-MS/MS)筛选前列腺癌差异表达蛋白。方法将前列腺穿刺活检的组织标本分为三组:良性前列腺增生组(20例)、前列腺癌组(20例)以及前列腺上皮内瘤组(10例)。对这些组织标本进行蛋白提取、定量和酶解。iTRAQ标记后(其中114标记良性前列腺增生组,116标记前列腺癌组,117标记前列腺上皮内瘤组),进行2DLC-MS/MS分析。利用ProteinPilot软件(版本3.0)对MS/MS肽段进行分析,在International Swissprot(090210,human)数据库中搜寻蛋白并定量。差异表达蛋白界值设定:大于1.5倍或小于0.66倍且P<0.05认为二者之间存在显著差异表达。Western-blot进一步验证了TPD52、Prohibitin-2、EF-Tu、Decorin的表达。结果总共鉴定出760种蛋白。相对于良性前列腺增生,前列腺癌差异表达蛋白共有46个,其中有20个蛋白明显上调,26个蛋白明显下调。Western-blot的验证结果与这些蛋白的表达变化相符合。结论通过iTRAQ技术分析得到的前列腺癌差异表达蛋白可靠,iTRAQ技术为筛选出有意义的前列腺癌生物标记物提供了一个良好的平台。