ApiAP2转录因子家族调控弓形虫生长发育的研究进展

弓形虫病是世界范围内危害最为严重的人兽共患寄生虫病之一。WHO数据显示,全球人群弓形虫抗体阳性率在25%—50%。孕妇感染弓形虫引起的垂直传播严重危害胎儿及婴幼儿健康,弓形虫感染也是引起免疫缺陷病人死亡的主要因素。在畜牧生产中,弓形虫病引起孕畜流产、死胎,危害严重。弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内原生动物寄生虫,属于顶复门原虫,生活史复杂,包括在中间宿主(人类和其他温血动物)的无性增殖和在终末宿主(猫科动物)的有性繁殖。为完成弓形虫在中间、终末宿主复杂的生命周期,其在不同发育阶段的转化及生长需要严格而精准的基因调控,因此揭示弓形虫生长发育的调控机制对治疗性药物和疫苗的研发具有重要意义。ApiAP2转录因子是一类具有AP2结构域和强大调节功能的蛋白家族,在疟原虫、弓形虫等寄生虫的生长发育中发挥核心调控作用,是阐明弓形虫不同生活史阶段发育与转化调控机制的突破口。弓形虫作为顶复门原虫研究的模式生物,有67个含AP2结构域的转录因子被注释,部分转录因子在弓形虫生命周期生长发育和转化过程中发挥核心调控功能,但尚有大部分AP2转录因子的生物学功能未知,尤其是针对有性繁殖阶段发育调控的研究较为匮乏。本文对已报道的弓形虫AP2转录因子的研究手段、生物学功能、调控的互作基因及网络进行系统梳理,旨在挖掘对弓形虫生长发育的重要节点起核心调控作用的基因或分子,在微观分子层面初步勾勒出弓形虫复杂生活史不同生长发育时期的调控机制,并对其在新型药物和疫苗研发中的作用及潜能进行展望。以期为动物弓形虫病的防控提供新的思路和切入点,阻断人弓形虫病的感染源,践行“人病兽防、关口前移”,实现“同一世界、同一健康”。

弓形虫组蛋白乙酰转移酶MYST-A对虫体蛋白质翻译后修饰的影响

为了探究弓形虫组蛋白乙酰转移酶MYST-A对弓形虫蛋白质翻译后修饰的影响,在弓形虫ToxoDB数据库获取基因全长序列,构建表达载体,大量纯化His标签重组蛋白质,免疫实验动物,制备多克隆抗体并纯化。利用间接免疫荧光实验对其进行亚细胞定位分析,用不同浓度的抗体作用于弓形虫并提取全虫蛋白,进行Western-blot验证,分析其是否对虫体蛋白质翻译后修饰产生影响。ALP2a蛋白质是组成组蛋白乙酰转移酶复合物的重要组成部分,MYST-A与ALP2a可能形成组蛋白乙酰转移酶复合物共同参与组蛋白的翻译后修饰,拟通过分子互作实验验证两者是否发生相互作用。结果表明:成功构建重组表达载体并纯化重组蛋白质His-MYST-A。His-MYST-A免疫小鼠以及兔子,并获得了特异性多克隆抗体。IFA分析结果表明:在细胞内的虫体中和游离速殖子中,弓形虫MYST-A均在虫体细胞质内广泛分布。MYST-A对弓形虫蛋白质翻译后修饰影响结果表明,随着抗体浓度的增加,泛素化、单甲基/二甲基化、丙二酰化、琥珀酰化的修饰水平均增强(尤其是55 kDa处),说明该蛋白质起负调控作用。分子互作实验验证MYST-A与ALP2a两者发生相互作用。研究进一步揭示了弓形虫组蛋白乙酰转移酶MYST-A对蛋白质翻译后修饰的重要调控作用,为深入研究其生物学功能奠定了基础。蛋白质翻译后修饰的研究对了解弓形虫的致病机制及其与宿主的相互作用、致病机制有重要意义,同时也为新型弓形虫疫苗研制及药物靶标的筛选提供一定的参考价值和理论依据。

环尾狐猴弓形虫感染诊治

四川某饲养单位于2022年7月起陆续发现环尾狐猴开始出现精神萎靡、不好动、食欲废绝等症状,且病程短、死亡率较高。通过实验室检测诊断为弓形虫感染,选择林可霉素、螺旋霉素、磺胺类等药物进行防治,取得了一定的治疗效果。

利用地理信息系统对我国羊弓形虫流行病学数据的调查与分析

为了解我国羊弓形虫的流行情况,本研究对1991年~2023年近30年收录的羊弓形虫流行病学文献中我国22个省区的94 891份临床羊血清样品数据,采用Arc GIS10.2软件中的点密度和核密度分析法分析羊弓形虫在不同地区采样点的分布及聚集性;采用Excel 2010软件统计不同省份、地区及7个地理分区羊弓形虫的平均阳性率(以下均简称为阳性率);采用SPSS软件对上述地区的阳性率进行卡方检验;通过Arc GIS10.2软件做羊弓形虫阳性率分级(阳性率分为6个等级)的统计分析,以分析羊弓形虫在不同地区的分布状况。点密度和核密度结果显示,除12个地区外其他地区均有羊弓形虫调查数据的报告;羊弓形虫在青海、甘肃、河南、内蒙古、云南、新疆等地呈点的聚集性分布,在青海和甘肃省呈密集性分布。统计结果显示,我国羊弓形虫平均阳性率为10.37%(8869/94891),不同省份的阳性率在3.09%~30.49%;7个地理分区羊弓形虫的阳性率为14.4%~30.49%,其中西南地区阳性率最高为30.49%(3059/12245),主要包括重庆、云南、贵州,羊弓形虫阳性率依次为45.06%(310/688)、28.63%(1830/6392)和17.79%(919/5165)。西北地区的阳性率最低,为14.4%(3879/58038),主要包括陕西、甘肃、新疆、青海,羊弓形虫阳性率依次为29.82%(99/332)、17.12%(1353/7905)、6.03%(487/8071)、4.56%(1940/41730)。分级统计结果显示,秦岭淮河以北的省份对羊弓形虫的流行病学调查较多,且平均阳性率为20%以下居多,大多属于1级、2级地区,但其中华北地区平均阳性率为20.78%(737/4562),为3级地区。秦岭淮河以南只有一半省份有调查数据,主要集中在西南地区,平均阳性率为30.49%(3059/12245),为4级地区;其次是华东、华中地区,阳性率分别为18.7%(422/2329)和16.32%(1584/15474),均为2级地区,但其中的重庆市可达5级。上述结果表明,我国大部分地区均存在羊弓形虫且呈地方性流行,西南、华北地区应加强对羊弓形虫流行病学的监测与防治。利用ArcGIS10.2软件分析羊弓形虫的分布与海拔等气候条件的关系;采用全域莫兰指数(Moran’s I指数)、高低值聚类(General G指数)分析羊弓形虫分布地区的空间自相关性。通过ArcGIS10.2软件对弓形虫分布的冷热点分析,结果显示,海拔2 000 m以下地区的羊弓形虫阳性率均较高,为10%~30%,且低海拔、高温高湿和雨热地区羊弓形虫的阳性率均较高,提示上述地区需加强对羊弓形虫流行病学的监控与防治。弓形虫感染的空间自相关性分析结果表明我国羊弓形虫的分布地区之间存在关联性(Moran’s I指数>0)和聚集性(General G指数>0),且分布点之间具有极强关联性(General G指数中的Z>0)。冷热点分析显示,我国秦岭淮河两侧的湖南和安徽部分地区、贵州、河南及西北地区的青海和甘肃大部分地区均为热点地区。因此要在集中养殖区重点监测及防治羊弓形虫病,以阻止羊弓形虫的聚集性流行。本研究对羊弓形虫病的科学防控决策的制定具有重要指导意义。

第十七次全国寄生虫学教学改革与课程建设研讨会 暨第二次弓形虫与弓形虫病学术交流会议纪要

由中华预防医学会医学寄生虫分会主办、安徽医科大学基础医学院病原生物学教研室与动物源性传染病安徽省重点实验室联合承办的第十七次全国寄生虫学教学改革与课程建设研讨会暨第二次弓形虫与弓形虫病学术交流会于7月12日至15日在安徽歙县顺利召开。此次会议汇聚了来自国内外60余家高校和科研院所的200余位学者,共同探讨了“在AI环境下和同一健康(One Health)理念指导下的人兽共患寄生虫学教学改革路径与经验”,并分享了国内外弓形虫与弓形虫病最新的研究成果。

安溪县布鲁氏菌病和弓形虫病血清学调查与分析

布鲁氏菌病和弓形虫病是危害严重的人畜共患传染病。为了解安溪县家畜猪牛羊布鲁氏菌病和弓形虫病感染情况,采集规模场和散养户家畜血清共2080份(猪1340份、羊560份、牛180份)进行2种病的血清学检测。结果显示:布鲁氏菌病阳性样品4份,总阳性率为0.2%,主要存在于羊样品中,羊感染率为0.7%。弓形虫病阳性样品69份,总阳性率为3.3%,其中猪阳性样品有50份,阳性率为3.7%;羊阳性样品有18份,阳性率为3.2%;牛阳性样品有1份,阳性率为0.6%。调查结果可为安溪县人畜共患传染病防控提供依据。

孕期感染弓形虫,是养猫引起的?

随着生活水平的提升,物质资料越来越丰富,人们不再关注温饱问题,而开始更高层次的精神追求;同时,由于社会竞争激烈、工作压力的增大,越来越多的人开始饲养宠物,以缓解工作压力。此外,现代社会独自生活的人越来越多或独处时间的增多,饲养宠物可以作为情感寄托和精神伴侣。诚然,饲养宠物确实有不少好处,但如果饲养宠物时管理不好,不仅宠物的排泄物会污染环境,而且宠物还会对主人的生命健康造成威胁,如弓形虫病。

弓形虫MIC1蛋白在杆状病毒系统中的表达及活性分析

为构建可溶性表达弓形虫MIC1蛋白质的重组杆状病毒株并分析重组蛋白质的活性,通过PCR扩增弓形虫mic1基因的编码序列并连接到pFastBac 1质粒中,将重组的转移质粒转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒,转染Sf9细胞后连续培养3代获得重组杆状病毒株。结果显示,Sf9细胞在感染后的第3天出现典型的细胞病变;间接免疫荧光和Western blot试验结果表明MIC1重组蛋白质在感染的Sf9细胞中成功可溶性表达;纯化的MIC1重组蛋白质不仅具有结合唾液酸乳糖的能力,同时能够刺激Balb/c小鼠产生较高水平的特异性抗体(>1∶25600)。以上结果表明,通过杆状病毒表达系统可获得具有生物学活性的弓形虫MIC1重组蛋白质。

我国青藏高原地区家畜弓形虫感染情况的Meta分析

为了系统分析我国青藏高原地区常见家畜的弓形虫感染情况,本研究利用Web of Science、中国知网数据库(CNKI)等6个数据库,检索有关我国青藏高原地区(以青海省和西藏自治区为主)家畜(牛、羊和猪)弓形虫感染率的文献,检索的时间范围从建立数据库至2022年10月1日。由2位评价者采用独立双盲方法进行文献筛选,提取数据资料并交叉校对、评价纳入研究的质量后,采用Stata 16.0软件进行Meta分析,通过Meta亚组分析和Meta回归分析探究合并结果的异质性来源,并评估发表偏倚。结果显示,共筛选获得29篇文献,3种家畜的研究皆存有异质性(牛:I^(2)=98.5%;羊:I^(2)=98.5%;猪:I^(2)=96.7%),异质性来源提示为采样范围和采样区域;合并后牛、羊和猪的弓形虫感染率分别为11%(95%CI=7%~15%)、13%(95%CI=8%~19%)和14%(95%CI=8%~20%);关于羊和猪的研究都具有发表偏倚(P<0.05),关于牛的研究无发表偏倚(P>0.05)。结果表明,我国青藏高原部分地区3种常见的家畜普遍存在弓形虫感染的情况。

实验动物弓形虫荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立实验动物弓形虫TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行初步应用。方法通过比对美国国家生物技术信息中心(NCBI)发表的弓形虫各毒株序列,选取其529 bp重复序列保守区域设计引物探针,建立弓形虫的荧光定量PCR方法。随后对方法的特异性和敏感性进行检验;取浓度为10^(6)~10^(2)copies/μL 10倍系列稀释的质粒标准品,每个浓度做3个平行,重复检测3次,计算组内和组间变异系数,评估方法的重复性和稳定性;用建立的荧光定量PCR方法及国标推荐的PCR方法检测14份犬组织样品和66份猪全血样品,以评估此方法在实际应用中的检测能力。结果建立的弓形虫荧光定量PCR方法在10^(8)~10^(1)copies/μL范围Ct值与质粒浓度呈线性关系,标准曲线Slope为-3.285,R^(2)值为1,扩增效率为10^(1).663%。可检测到的弓形虫最低浓度为10^(1)copies/μL;与其他14种实验猪常见病原不发生交叉反应;重复检测10^(6)~10^(2)copies/μL质粒标准品,组内变异系数小于1.21%,组间变异系数小于0.62%。用建立的弓形虫荧光定量PCR方法和国标PCR方法对14份犬组织样品和66份猪全血样品进行检测,结果显示,弓形虫荧光定量PCR方法和国标PCR方法检测的阳性率分别为10%(8/80)和7.5%(6/80),阳性符合率达到100%。结论建立的弓形虫荧光定量PCR方法可以有效地检测弓形虫,为实验动物弓形虫日常监测提供良好的方法。

犬弓形虫巢式PCR检测方法的建立及初步应用

弓形虫病是一种重要的人兽共患病,犬是弓形虫重要的中间宿主,有必要建立一种快速、灵敏的犬弓形虫病检测方法。根据GenBank中弓形虫529 bp基因重复序列设计巢式PCR引物,通过优化反应条件建立巢式PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬新孢子虫的基因扩增无条带;灵敏度试验结果显示,该方法最低可以检出0.134 pg的弓形虫基因,比目前国标PCR方法高100倍。对感染弓形虫犬的组织样品检测发现,巢式PCR能在感染犬的不同组织中检测出弓形虫基因。建立的犬弓形虫巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为该病的检测奠定了基础。

猪弓形虫病阻断ELISA方法的建立及初步应用

本研究利用制备的GRA7单克隆抗体为基础建立猪弓形虫病的阻断ELISA方法。以rGRA7重组蛋白免疫小鼠,取脾细胞进行细胞融合,筛选出4株能够稳定产生单克隆抗体的阳性单克隆细胞株。经对此单克隆抗体进行IFA和Western blot检测确认成功制备GRA7蛋白的单克隆抗体后,以重组蛋白为包被抗原对阻断ELISA方法进行优化后,经过重复性、交叉性、符合性实验验证本方法具有可重复性,与MAT符合性高。初步应用于288份临床样品检测,检出率为11.46%,与MAT检测结果重合率为84.8%。本研究成功制备弓形虫GRA7蛋白的单克隆抗体,并建立了一种猪弓形虫病的阻断ELISA方法,为弓形虫病的检测提出了新的方案。

刚地弓形虫AP2家族蛋白质研究进展

弓形虫是一种专性寄生于细胞内的顶复门原虫,具有多宿主、多阶段的发育周期。弓形虫有性阶段仅限于猫科动物,而无性阶段发生在包括人类在内的大多数温血动物中。全世界大约有三分之一的人感染弓形虫病,同时该病也能够对畜牧业造成严重经济损失。刚地弓形虫具有一套复杂的基因调控网络,能够使虫体在适应不同的外界环境变化时及时在特定的阶段进行自身基因的转录及表达。然而,目前人们对其潜在的转录调控机制知之甚少。研究发现特异性的转录因子(transcription factors,TFs)在真核生物的转录调控中具有重要作用,特别是AP2(apetala 2,AP2)家族转录因子参与了弓形虫不同阶段基因表达过程,这些因子在寄生虫生长和发育过程中发挥极其重要的作用。本文结合近几年的研究成果,对弓形虫转录因子AP2家族蛋白质的研究进展进行汇总,以期为深入研究弓形虫的生物学特征奠定基础。

影响刚地弓形虫组织包囊体内外形成因素的研究进展

在刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)发育为成熟组织包囊(bradyzoites)和卵囊(sporozoites)的两个时期,传统上需要进行动物试验,这极大地阻碍了对这些阶段的形态和代谢的生物学研究,而此阶段对弓形虫的感染至关重要。因此,在研究组织包囊时利用体外诱导的方法成为研究的重要途径,近年来这方面的研究也取得了一些突破性进展。文章综述了影响组织包囊形成的因素,旨在为弓形虫病的研究、预防和控制提供参考。

弓形虫GRA1蛋白单克隆抗体的制备与间接免疫荧光检测方法的建立

本研究旨在利用原核表达系统表达弓形虫GRA1蛋白并制备单克隆抗体,用于弓形虫病的诊断及GRA1蛋白功能研究。以弓形虫cDNA为模板,设计引物扩增GRA1基因片段,构建原核表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达蛋白并纯化。用纯化后的重组蛋白作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体并鉴定。以制备的弓形虫GRA1单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,优化反应条件建立弓形虫间接免疫荧光检测方法。结果表明:成功构建了原核表达质粒pET-30a(+)-TG-GRA1;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白GRA1为可溶性表达,分子量约为27 kDa;Western blot结果显示重组蛋白GRA1可被犬弓形虫阳性血清识别,表明GRA1有良好的反应原性。成功筛选出5株单克隆细胞株,分别命名为1-B10、2-C3、2-C9、3-C11以及6-E6,并对它们进行亚型鉴定,其中2-C3、2-C9、3-C11为IgG1,1-B10、6-E6为IgM;IFA结果显示单克隆抗体具有良好的反应原性;建立了mAb 2-C9最佳稀释浓度为0.875μg/mL、最佳孵育时间为1.5 h,FITC标记的羊抗鼠IgG最佳稀释倍数为1∶400、最佳孵育时间为1.5 h的间接免疫荧光检测方法,并对15只小鼠的肝脏组织切片进行检测,结果表明该方法可用于弓形虫动物组织切片的检测,有助于弓形虫感染的实验室诊断及弓形虫的动态分布研究。

弓形虫多表位PLGA纳米疫苗的研究

构建弓形虫多表位PLGA纳米疫苗并评估其可行性,预测弓形虫TgMIC3蛋白的B、T淋巴细胞优势抗原表位,联合抗原表位SAG1((238-256))、GRA7((20-28))和AS15,构建出新型多表位肽,用生物信息学工具对其理化性质、三级结构和分子对接能力等特征进行分析;原核表达并纯化多表位重组蛋白(multi-epitope protein, MEP),通过Western blot鉴定纯化效果;搭建MEP-PLGA纳米递送体系,对纳米颗粒进行表征。结果表明,多表位肽为亲水性蛋白非过敏原,具有一定抗原性,抗原表位均呈现在蛋白表面,能与MHC分子H-2-Dd稳定结合;可在BL21(DE3)大肠埃希氏菌表达系统中稳定表达,并能被特异性抗体所识别;构建的MEP-PLGA纳米递送体系包封为54.42%,纳米颗粒饱满,大小均一。成功设计并构建出弓形虫多表位PLGA纳米疫苗,为弓形虫新型纳米疫苗的研发奠定了基础。

弓形虫感染与脑炎因果关系的双样本孟德尔随机化分析

目的利用孟德尔随机化(MR)分析探究弓形虫感染与脑炎的因果关系,并通过免疫组化观察脑组织中的弓形虫包囊分布和炎症情况。方法获取弓形虫感染和脑炎的全基因组关联分析数据,筛选出单核苷酸多态性(SNPs)位点,以逆方差加权法为主进行MR分析,以OR值及95%CI评价弓形虫感染与脑炎之间的因果关系。利用异质性检验、水平多效性检验、留一法进行质量控制。利用Wh6弓形虫包囊感染的小鼠脑组织切片进行免疫组化染色,使用Image J软件进行图片分析。结果筛选出29个弓形虫感染与脑炎存在相关性的SNP,IVW方法结果提示弓形虫感染使得脑炎的患病分险为原来的0.98倍(OR=0.98,95%CI为0.76~1.27),显示两者无因果关系。质量控制结果提示筛选出的SNPs具有稳定可靠性。弓形虫包囊在脑组织各部位分布不同。结论弓形虫感染与脑炎具有相关性,但未有充分证据证明二者之间存在因果关系。

弓形虫MIC1、MIC6和ROP18混合蛋白对小鼠的免疫保护作用

为评估弓形虫微线体蛋白MIC1、MIC6和棒状体蛋白ROP18组成的重组疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用,我们将重组表达的MIC1、MIC6和ROP18三种蛋白进行不同的组合,并联合弗氏佐剂通过皮下注射的方式免疫小鼠。用ELISA技术检测免疫后小鼠血清特异性抗体,以及免疫蛋白刺激后脾细胞培养上清中各细胞因子的水平,通过脾淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞增殖情况。最后一次免疫后,用弓形虫WH3强毒株攻击,观察并记录小鼠的存活情况。结果表明,与对照PBS组相比,蛋白免疫组产生高滴度的IgG和IgG亚型(IgG1和IgG2a)抗体,滴度可高达1∶128000。细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ表达水平不同程度地升高,并且重组蛋白能够诱导淋巴细胞特异性增殖。免疫组小鼠的生存时间较对照组有所延长,其中MIC6-ROP18组延长时间最长(P<0.01)。MIC1、MIC6和ROP18组成的重组疫苗能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,其中MIC6-ROP18蛋白组合的免疫保护效果更为明显,但仍需进一步改进。本研究为弓形虫疫苗的研发提供了思路。

弓形虫肌动蛋白抗原表位抗体的制备及应用

制备弓形虫肌动蛋白(TgActin)多肽表位抗体并探讨其应用价值。BepiPred 1.0 Server在线分析设计TgActin抗原表位,并与多种属Actin进行同源比对,选取并合成高特异性多肽片段序列免疫新西兰兔。末次免疫后收集兔血清并使用Protein G纯化抗体,SDS-PAGE检测抗体纯度,ELISA测定抗体效价,Western blot分析抗体的特异性及TgActin表位抗体作为内参抗体的可能性,免疫荧光观察胞内速殖子形态。结果显示,ELISA测定抗体效价为1∶128000,Western blot结果显示抗体特异性识别弓形虫Actin,免疫荧光染色显示TgActin表位抗体可以标记纳虫泡内速殖子。结果表明,成功制备了TgActin多肽表位抗体,可用做弓形虫蛋白检测的内参抗体及其在细胞内的免疫荧光检测,为后续弓形虫研究提供了便利条件。

双胞胎先天性弓形虫病一例

病例资料患儿A,女,30天,双胞胎姐姐,胎龄35周,因胎膜早破剖宫产出生,出生时体重1.44 kg,羊水清,无窒息抢救史,出生后Apgar评分为10分。于外院行眼底检查发现双眼视网膜病变,遂来我院检查,眼底检查提示“右眼弓形虫病变?左眼早产儿视网膜病变”,查体:头围32 cm,骨缝增宽,前囟饱满,全身轻度花斑纹,其他无异常。否认发病前14天内曾接触活禽或野生动物。MRI:左侧侧脑室前角旁见斑片状短T_(1)、长T_(2)信号;右侧侧脑室后角前方见片状短/长T_(1)、长T_(2)信号,边缘见环状短T_(2)信号;双侧额叶、右侧顶颞枕叶见大片状长T_(1)、长T_(2)信号。透明隔腔、双侧侧脑室、第三脑室、第四脑室扩大。扩散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)示右侧基底节区边缘环形高信号、中央低信号病灶,大小约57 mm×64 mm。磁敏感成像(susceptibility weighted imaging,SWI)示左侧侧脑室前角旁、右侧侧脑室后角前方局部斑点状相位图、幅度图低信号(图1)。