弓形虫RH、B_(36)、Fukaya株毒力及致病性的比较研究

目的探讨不同毒力的弓形由株与其致病性的关系、方法应用体外培养和动物模型观察ＲＨ、Ｂ３６、Ｆｕｋａｙａ三虫株对组织细胞的损害及其致病、致畸、致死的差异。结果Ｖｅｒｏ细胞在８ｈ内的侵袭率及分解产物脂肪酸含量以Ｂ３６株为高。胞内２４ｈ繁殖数以ＲＨ株为最多，Ｂ３６次之，Ｆｕｋａｙａ最低。此结果与虫体对细胞的损害程度、对仔鼠智力发育的影响密切相关。细胞因子激活巨噬细胞后，对弓形由抑虫或杀虫程度与ＮＯ浓度相一致。结论ＲＨ株ＮＯ浓度高，胞内虫株可被完全消灭，ＮＯ可能参与抗虫作用。

弓形虫ZS_2和RH株基因差异表达的研究

从RH和ZS2株弓形虫抽提纯化mRNA,经反转录后获得的双链cDNA分别作为driver和tester,采用抑制消减杂交技术(suppressionsubstractionhybridization,SSH)技术扩增ZS2株中差异表达的基因.电泳图谱显示消减的cDNA与未消减的cDNAPCR扩增产物存在明显的差异,说明ZS2和RH株弓形虫转录水平存在着差异.

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅱ．RH株速殖子细胞培养上清对成囊株速殖子侵入细胞的影响

本文以ＲＨ株细胞培养上清（ＳＲＣ）替代ＰＬＡ２加入培养系统，对三株成囊株４次培养及与含ＰＬＡ２对照培养的观察表明，含ＳＲＣ的培养系统较常规培养检出时间提前，阳性率提高，在本文条件下与含ＰＬＡ２４０Ｕ者效果相当，提示ＳＲＣ可作为ｐＬＡ２的廉价实用的替代物用于弓形虫病的病原检测。

RH株弓形虫无性生殖期E/S蛋白动态变化及功能推测

对RH株弓形虫在鼠体内无性生殖的不同时期分泌 /排泄蛋白 (E/S) ,采用SDS PAGE技术进行了研究 ,结果表明在无性生殖的不同时期E/S呈现动态的变化 ,P93出现于感染后第 1天 ,P72、P39.5、P30、P2 4.5、P2 3.5、P14.4出现于感染后第 2天 ,P45 .5、P43、P2 7出现于感染后第 3天 .

ME 49株弓形虫速殖子对昆明小鼠的致病性

【目的】通过ME 49株弓形虫速殖子对小鼠致病性的研究,了解该虫株速殖子的毒力特点,为深入研究弓形虫弱毒株的致病特征提供研究基础。【方法】以ME 49株弓形虫速殖子为研究对象,用血球计数板将速殖子梯度浓度稀释为<10~0,10~0-10~6个/mL,腹腔注射昆明小鼠,死亡小鼠的组织直接涂片检测肺脏及肠系膜淋巴结速殖子或大脑组织中弓形虫包囊数量,肺脏常规石蜡切片进行H.E及IHC染色,统计涂片和MAT方法的结果分析弓形虫的感染情况,并统计小鼠的感染率和生存率。【结果】0-60 DPI,死亡小鼠组织涂片显微镜检查和MAT法检测小鼠血清中弓形虫IgG抗体结果显示,<10~0、10~0、10~1及≥10~2速殖子浓度组小鼠的弓形虫感染率分别为0、20%、60%及100%。10~4速殖子浓度组小鼠有3只分别在12、16、19 DPI死亡;10~5速殖子浓度组小鼠有2只在11 DPI死亡,1只在8 DPI死亡;10~6速殖子浓度组小鼠有2只在9 DPI死亡,在7、8、10 DPI各死亡1只,感染弓形虫的小鼠生存率为62.07%(18/29)。对死亡小鼠的肺脏和肠系膜淋巴结直接涂片,显微镜镜检可见弓形虫速殖子;H.E及IHC染色,肺脏可以观察到弓形虫包囊及弓形虫抗原。对<10~0、10~0、10~1及10~2处死小鼠的大脑组织研磨镜检,结果显示<10~0和10~0感染组阳性小鼠大脑中弓形虫包囊数均为0;10~1感染组阳性小鼠大脑中弓形虫包囊数分别为60、100和0;10~2感染组阳性小鼠大脑中弓形虫包囊数量分别为20、40、40、60和0。60-600 DPI,10~3速殖子浓度组小鼠在184、435和569 DPI各有1只死亡,大脑中未检测到弓形虫包囊;10~5速殖子浓度组小鼠1只在188 DPI死亡,大脑包囊数量为20,其余小鼠存活时间为590 DPI。【结论】本研究探讨了ME 49株弓形虫速殖子对昆明小鼠的致病性,≥10~2速殖子浓度可引起小鼠100%感染,10~6速殖子浓度可引起小鼠100%死亡,小鼠死亡的时间为7-19 DPI,感染小鼠生存率为62.07%(18/29),大脑包囊成囊率为53.85%(7/13),平均包囊量为0-53个包囊/小鼠大脑,最长存活时间590 DPI。ME 49株弓形虫速殖子对小鼠致病性较弱,大脑可见弓形虫包囊,高浓度速殖子可引起小鼠死亡。

刚地弓形虫ME49株对体外培养的小鼠胎盘滋养细胞凋亡的影响

目的研究刚地弓形虫ME49株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞凋亡的影响。方法制备小鼠胎盘滋养层细胞并分别接种于不同细胞培养板,对照组加入DMEM高糖培养液孵育,实验组加入相同体积不同密度(2×106/ml、4×106/ml、8×106/ml)弓形虫速殖子培养8h后,AnnexinⅤ-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点细胞凋亡率变化,以蛋白质印迹法分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。结果流式细胞仪检测弓形虫感染后的滋养层细胞凋亡率较对照组有升高趋势(P<0.05),呈量效依赖性,弓形虫密度8×106/ml组8h凋亡率最高,为28.37%;荧光显微镜观察,随弓形虫感染密度增加,滋养层细胞凋亡数目增多。蛋白质印迹法检测刚地弓形虫ME49株作用于滋养层细胞8h后实验组的Bax、Bcl-2蛋白表达(与β-actin比值)各为1.24±0.05、1.37±0.03、1.78±0.04与1.15±0.03、1.09±0.05、0.97±0.01,较对照组的比值(1.17±0.06和1.23±0.02)有明显的改变(P<0.05)。结论刚地弓形虫ME49株可促进体外培养的孕期小鼠滋养细胞正常凋亡,其机制可能与滋养细胞Bax表达上调和Bcl-2表达下调有关。

刚地弓形虫RH株对小鼠胎盘滋养细胞凋亡的影响

目的通过研究刚地弓形虫强毒株RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞凋亡的影响,初步探讨不同毒力虫株引起病理妊娠的机制。方法将小鼠胎盘滋养层细胞分别接种于不同细胞培养瓶,对照组加入DMEM培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×106/ml、4×106/ml、8×106/ml)弓形虫速殖子培养2、4、8h,Annexin-V-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点细胞凋亡率变化;荧光显微镜观察细胞形态改变情况;Western blot分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达或活性。结果流式细胞仪检测弓形虫感染后的滋养层细胞凋亡率较对照组有下降趋势(P<0.05),呈量效依赖性,弓形虫数量8×106/ml实验组8h凋亡率最低,为(15.81±0.19)%;荧光显微镜观察到8h不同数量实验组滋养细胞凋亡形态改变情况,各组均有典型的早期凋亡细胞:细胞膜着绿色,细胞核拒染。随着弓形虫感染数量增加,凋亡细胞数目有所减少。Western blot检测刚地弓形虫RH株作用于滋养层细胞8h后实验组的Bax、Bcl-2蛋白表达较对照组分别有明显的降低与升高(P<0.05)。结论刚地弓形虫RH株可抵抗体外培养的孕期小鼠滋养细胞正常凋亡,其机制可能与滋养细胞Bax表达下调和Bcl-2表达上调有关。

刚地弓形虫RH株感染对小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响

目的研究刚地弓形虫RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响及相关机制。方法制备小鼠胎盘滋养层细胞并分别接种于不同细胞培养皿,对照组加入DMEM高糖培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×104/mL、4×104/mL、8×104/mL)弓形虫速殖子培养6h、12h、24h;以MTT法检测滋养细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞周期;Western印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclinA、cdk2表达或活性。结果 MTT法检测结果显示刚地弓形虫RH株抑制滋养层细胞增殖,且呈时间剂量依赖性;流式细胞仪检测24h感染组细胞周期在S期产生阻滞,8×104/mL数量组S期细胞比例高达68.73%±1.76%;Western印迹方法分析感染弓形虫组滋养层细胞的cyclinA、cdk2蛋白表达量较对照组明显下降(P<0.05)。结论刚地弓形虫RH株能够抑制小鼠胎盘滋养层细胞增殖并通过调节cyclinA、cdk2等蛋白表达或活性改变引起细胞S期阻滞。

弓形虫RH株速殖子在体外形成包囊的观察

弓形虫ＲＨ株速殖子在ＨｅＬａ细胞内生长第７天出现包囊样结构，透射电子显微镜观察培养１４ｄ的包囊显示高致密度均匀一致的囊壁。

中国4个弓形虫虫株GRA6基因的比较分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株,以及国际标准强毒株RH株的致密颗粒抗原(GRA6)基因进行PCR-RFLP分析,首次对中国弓形虫虫株进行了基因分型研究,旨在了解中国弓形虫基因型的分布情况,从而为进一步的分子遗传学研究以及弓形虫病的防制提供资料。PCR-RFLP分析显示两种带型:RH、SH、CN3株弓形虫为一种带型,QH和ZS2株弓形虫为另一种电泳带型。GRA6序列分析结果显示:RH、SH、CN3株弓形虫的GRA6基因序列上的MseΙ酶切位点与国外报道的RH株一致,同属于基因型Ι,为强毒株;QH和ZS2株弓形虫的MseΙ酶切位点与国外报道的弱毒株BEVERLEY株和ME49株一致,同属于基因型Ⅱ,与PCR-RFLP分析结果一致。除MseΙ酶切位点外,中国的几个虫株GRA6序列与GenBankTM注册的RH株及BEVERLEY和ME49两个弱毒株有个别碱基的差异。结果证明中国人源弓形虫包含了Ι、Ⅱ两种基因型,而动物源性弓形虫则因宿主和来源地不同亦有Ι、Ⅱ两个基因型。

基于CRISPR/Cas9技术的弓形虫rop16_(I/III)缺陷虫株的构建及毒力鉴定

目的构建并鉴定弓形虫RH株rop16_(I/III)缺陷虫株。方法利用CRISPR-Cas9技术进行构建基因缺陷虫株。运用E-CRISPR数据库设计gRNA,并使用定点突变试剂盒突变pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒上的gRNA,构建pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒。此外将rop16上游序列、乙胺嘧啶抗性基因、rop16下游序列3个片段连接成donorDNA,克隆于pUC19质粒上,PCR扩增donor DNA片段。pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和donor DNA片段电穿孔转染弓形虫,电转后悬液接种于HFF-1细胞中,3μmol/L乙胺嘧啶筛选电转后的虫株。PCR和Western blotting鉴定克隆化筛选虫株。吉姆萨染色分别比较RH株和RHΔrop16株对HFF-1细胞的增殖与入侵。并比较RH株和RHΔrop16株分别感染昆明小鼠后小鼠的生存和死亡率。结果经测序比对,成功构建了pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和pUC19-donorDNA质粒。PCR鉴定结果显示,DHFR编码(编码乙胺嘧啶抗性基因)序列成功插入至靶点位置,Western blotting分析结果未见RHΔrop16株有Rop16_(I/III)蛋白表达。吉姆萨染色后计数结果表明,RH株感染的细胞内每个纳虫泡内速殖子的平均数显著高于RHΔrop16虫株。毒力试验结果显示,RH株感染的小鼠在第7d即出现死亡,而rop16_(I/III)缺陷株在第9d出现死亡,但两种弓形虫株感染动物在第10d均全部死亡,两组间无统计学差异。结论利用CRISPR-Cas9技术成功构建了rop16_(I/III)缺陷的弓形虫RH虫株,rop16_(I/III)基因敲除对弓形虫RH株毒力无明显影响。

弓形虫截短SAG2基因的克隆表达与免疫活性分析

构建截短的弓形虫表面抗原2(SAG2)原核表达系统,并探讨其抗原活性。PCR扩增去掉信号肽和C-末端的SAG2基因片段,插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α,并用IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blot鉴定重组SAG2t的表达及其免疫反应原性。每升菌液约纯化出4mg rSAG2t蛋白;Western blot显示,ME49株感染的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可强烈识别表达的截短SAG2蛋白。原核表达体系实现了截短的SAG2蛋白的可溶性表达,并具有良好的完全抗原活性。

弓形虫ITS及5.8S序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株,以及国际标准强毒株RH株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5 8SDNA序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析,旨在对国内不同宿主间弓形虫虫株的遗传变异情况进行分析和验证,为分子遗传学和分子诊断学研究提供资料。结果显示:QH绵羊株、ZS人株、SH人株、CN猪株的ITS及5 8S序列完全一致,且与GenBank上注册RH株的ITS及5 8S序列也一致;仅实验室传代保存的RH株的ITS2序列与其它4株的ITS2有2个碱基的差异。结果表明ITS可作为分子标记用于弓形虫与其它原虫的种间鉴定,但不适合用于弓形虫种内遗传变异的研究。

弓形虫SYBR-Green1荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立SYBR-Green1荧光定量PCR检测弓形虫的方法,并进行实验室方法学评价。方法常规PCR扩增弓形虫RH株高度保守的B1基因部分序列,经TA克隆后转化入大肠埃希菌JM109中。提取重组质粒,PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green1荧光定量PCR标准曲线,并做重复性试验,对桂弓、B36虫株及恶性疟原虫、血吸虫基因组DNA、30份孕产妇标本1、221份无偿献血者标本进行检测。结果用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数0.997,平均试验间变异系数0.81%,检测桂弓、B36虫株均为阳性,而检测血吸虫、恶性疟原虫基因组DNA均为阴性;孕产妇检测阳性率16.7%,平均拷贝数为1.19×105cop-ies/μl;无偿献血者阳性率为0.74%,平均拷贝数为1.17×105copies/μl。结论成功建立了检测弓形虫B1基因的SYBR-Green1荧光定量PCR方法,较常规PCR技术更快捷、敏感、准确,适合临床实验室及无偿献血者的筛查使用。

三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR与ELISA检测弓形虫的比较

目的选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为real-timePCR检测的靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。方法将529bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆、测序构建标准品;将构建的3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR。结果 529bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数(R2)均为0.998,并且扩增效率均为96.724%,扩增片段的Tm值分别为86.5±0.5℃、78.8±0.5℃、83.1±0.5℃;构建的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR特异性试验表明,529bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值分别是86.2℃、78.9℃和83.3℃,阴性对照无扩增曲线;敏感性试验表明,529bp、ITS-1和B1序列最低检出限分别为173copies/μL、123copies/μL、和135copies/μL;Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.13%;ELISA检测猪弓形虫IgG抗体的阳性率41.72%,ELISA与荧光定量PCR检测核酸阳性符合率为53.44%(P<0.01)。结论建立弓形虫三重SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测技术具有高特异性和敏感性。

桦褐孔菌粗多糖对急性弓形虫感染雄性小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响

[目的]探讨桦褐孔菌粗多糖对弓形虫感染小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响。[方法]用3种剂量桦褐孔菌粗多糖治疗弓形虫感染所致的睾丸生精障碍小鼠,使用流式细胞仪检测生精细胞凋亡率,并设立空白对照组、阴性对照组和阳性对照组进行对比。[结果]与阴性对照组比较,桦褐孔菌粗多糖高剂量组的睾丸生精细胞凋亡率极显著降低(P<0.01)中剂量组及阳性对照组的睾丸生精细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。[结论]桦褐孔菌粗多糖具有修复睾丸病理损伤并降低睾丸生精细胞凋亡率的作用。

桦褐孔菌粗多糖对急性感染弓形虫小鼠的存活时间及SOD的影响

为探讨桦褐孔菌粗多糖(IOCP)对急性感染弓形虫小鼠的存活时间及血清、心、肝和肺中超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响。采用昆明系小鼠80只,随机分为IOCP组、阳性对照组(蒿甲醚)、空白对照组和阴性对照组,每组20只。用RH株弓形虫建立小鼠病理模型,观察小鼠治疗后的存活时间,以及血清、心、肝和肺中SOD含量。结果:IOCP及阳性药物均可延长感染弓形虫小鼠的存活时间;可明显提高小鼠脏器SOD活性;与阳性对照组比较差异显著(P<0.05)。结论:IOCP能延长感染弓形虫小鼠的存活时间,并具有抗氧化损伤作用。

桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠生殖器官及其胎鼠发育的影响

为探讨桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠生殖器官及其胎鼠发育的影响,采用弓形虫RH株感染雌性性成熟小鼠,以蒿甲醚为阳性对照组,桦褐孔菌多糖为试验组,并设立阴性组和模型组。观察孕鼠胎儿的死胎数、体重、体长等发育指标,同时记录剖检前各组孕鼠死亡数和受孕数,并对孕鼠的生殖器官进行病理组织观察。经统计分析,桦褐孔菌多糖组与模型组在孕鼠死亡率和受孕率方面差异极显著(P<0.01);在死胎率、活胎鼠平均体重、活胎鼠平均体长方面差异也极显著(P<0.01);而两药物组仅在受孕率方面显著差异(P<0.05),其孕鼠生殖器官的病理组织仅呈轻微的炎症变化。表明桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠的胎鼠发育具有保护作用;并可明显缓解弓形虫感染对孕鼠生殖机能的损害。

Chinese 1型弓形虫在终宿主家猫肠内发育的研究

目的观察研究TgCatCHn4(Chinese 1)株弓形虫在猫回肠上皮细胞发育过程中的虫体形态特点,对小鼠RH株弓形虫急性感染期的病理变化和虫体分布进行探讨。方法复制弓形虫感染的终末宿主和中间宿主模型,采用石蜡切片H&E染色和IHC染色方法。结果家猫摄入弓形虫包囊后,可成功排泄弓形虫卵囊(3DPI^10DPI)。回肠病理变化主要表现为吸收细胞脱落和固有层淋巴细胞的坏死,可观察到弓形虫在回肠上皮裂殖生殖和配子生殖各阶段虫体的形态。RH株弓形虫感染的小鼠病理损伤主要表现为肝脏、脾脏和淋巴结的局灶性坏死,坏死灶分布多量速殖子,虫体多以花瓣状、簇状分布。结论详细探讨了弓形虫感染猫和小鼠后的虫体形态学和对机体的病理损伤特点,为弓形虫在终末宿主和中间宿主的病理诊断和入侵机制研究提供参考依据。

弓形虫主要表面抗原1核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫保护作用的研究

目的研究刚地弓形虫RH株主要表面抗原1(P30)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法根据弓形虫P30基因的DNA序列设计一对引物,,将PCR扩增到的P30基因克隆到真核表达载体pcDNA.3.1中。大量制备pcDNA3.1-P30和pcDNA3.1质粒DNA。将48只BALB/c小鼠随机分成4组,每组12只,空质粒对照组(A组)第0、2、4周经小鼠股四头肌注射100μgpcDNA3.1质粒DNA;重组P30抗原免疫组(B组)第0、2、4周每鼠经背部皮下多点注射50μgrP30+福氏完全佐剂;P30DNA疫苗免疫组(C组)第0、2、4周经小鼠股四头肌注射100μgpcD-NA3.1-P30质粒DNA;P30DNA疫苗和重组P30抗原联合免疫组(D组)第0、2周经小鼠股四头肌注射100μgpcDNA3.1-P30质粒DNA,第4周每鼠经背部皮下多点注射50μgrP30+福氏完全佐剂。末次免疫4周后每鼠用100个弓形虫速殖子经腹腔感染,观察小鼠存活时间。结果成功构建刚地弓形虫RH株P30DNA疫苗,动物保护性实验表明,虽然与对照组相比实验组小鼠的存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论pcDNA3.1-P30DNA疫苗具有弓形虫病候选DNA疫苗分子的潜力。