改进型外部引导序列抑制人巨细胞病毒UL49基因的表达(英文)

外部引导序列(EGS)技术(The EGS-based technology)是一种新型的基因沉默技术,能诱导内源性的核酶P(RNase P)对靶mRNA进行有效切割.以人类巨细胞病毒(HCMV)UL49基因mRNA片段为靶序列,基于前人实验基础上设计出更为精简与高效的改进型EGS(miniEGS),DNA片段长度仅为12bp.构建稳定表达HCMVUL49的细胞系,通过应用荧光定量PCR及Western印迹分别鉴定miniEGS对内源性UL49的抑制效率.结果显示,miniEGS能在HeLa细胞中能达到很高的转染效率(97.9%),并且在转染稳定表达UL49的HeLa细胞系后,发现UL49基因的mRNA与蛋白表达水平都出现明显下降(50%).研究表明,改进型的EGS序列不仅能有效抑制目的基因的表达,同时因其序列设计的精简性与高效性,可更好地应用到以后的抗病毒研究中.

序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)结合血清学在疑难血型鉴定中的应用

目的 探讨血型血清学与序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)基因分型在ABO疑难血型鉴定中的作用。方法 用血清学分析鉴定的ABO疑难血型标本80例,同时采用PCR-SSP法进行基因分型,结合两种方法学结果,确定血型及制定输血策略。结果 血清学鉴定亚型40例,其他原因引起的抗原抗体缺失或减弱正常血型40例;PCR-SSP法基因分型亚型41例(3例二者结果不一致:血清学Ael型1例,基因分型O2O2;血清学O型1例,基因分型BO1;血清学A型1例,基因分型AB),正常血型39例。结论 使用血清学结合基因分型鉴定ABO疑难血型具有重要意义。

应用外部引导序列切割人巨细胞病毒UL148 RNA的研究

目的 研究人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）临床病毒株UL/b＆#39;区域UL148基因功能及抗HCMV治疗新策略,应用DNA性质外部引导序列（External guide sequences,EGS）在体外抑制UL148 RNA的表达.方法 应用RNA structure生物软件模拟UL148 RNA二级结构,选择二级结构相对简单的区域设计EGS,并合成EGS核苷酸序列.应用PCR方法分别扩增UL148及M1RNA基因,克隆至T7启动子下游,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录UL148 RNA及M1RNA,其中UL148以32p标记并进行体外转录.混合EGS、M1RNA及UL148 RNA于切割反应液中,反应1h后,进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,Typhoon扫描仪观察结果.结果 根据UL148 RNA二级结构选取第58 ～72位碱基作为EGS结合区域,其切割位点位于57位,针对此区域设计EGS57,并在体外进行EGS57与UL148 RNA结合的二级结构的模拟,可形成M1RNA天然作用底物类似的茎环结构.在T7 RNA聚合酶的作用下,分别在体外转录M1RNA及UL148 RNA,其大小均与预期相符.经切割反应,可获得与预期切割位点相符的切割条带.结论 EGS57可切割UL148RNA,其切割位点准确,与预期相符.该研究为进一步探讨UL148基因功能提供有效基因沉默工具.

引导RNase P对HCMV UL54 mRNA片段体外切割的EGS构建

HCMV是一种广泛存在的疱疹病毒,在免疫抑制和免疫功能低下人群中,HCMV感染可引起严重疾病。RNase P是细胞内催化tRNA5′末端成熟的酶,当EGSs与靶mRNA互补结合并形成类似tNRA的复合物时,大肠杆菌RNase P催化亚基M1 RNA可具备对靶mRNA特异的催化切割活性。为研究抗病毒制剂,针对HCMV DNA多聚酶UL54 mRNA设计并构建特异性的EGS-C6,通过对UL54基因亚克隆片段转录产物体外切割研究,证实该EGS具备引导M1 RNA对UL54 mRNA特异切割的能力,可发展成一种新型抗病毒制剂。

AIDS继发的Kaposi肉瘤相关性人类疱疹病毒独特DNA序列的发现和研究进展

ＡＩＤＳ继发的Ｋａｐｏｓｉ肉瘤相关性人类疱疹病毒独特ＤＮＡ序列的发现和研究进展胡立胜胡晓年封绍奎１综述，沐桂藩２审校中国协和医科大学（１００００５）Ｋａｐｏｓｉ（ＫＳ）是ＡＩＤＳ病人最常见的继发肿瘤，继发概率约为１５～２０％，或继发的终生危险度接近５...

不同的引导肽对丝状噬菌体基因8蛋白展示外源多肽的影响

为了研究不同的引导肽对在基因8蛋白上展示外源多肽的影响,利用基因工程方法将一短肽插入基因8蛋白的N端,并将引导多肽去除或用基因3蛋白的引导肽序列替代基因8的引导肽序列.采用放射性脉冲追踪技术检测不同的引导肽对在基因8蛋白上展示外源多肽的作用.结果表明,无引导肽序列的引导,蛋白前体无法向成熟蛋白转化.基因3蛋白的引导肽可以引导展示有外源多肽的基因8蛋白,完成从前体向成熟蛋白的转化,但转化率明显下降.研究结果对阐明噬菌体外壳蛋白在大肠杆菌中的跨膜机制具有重要的意义.

SL反式剪接:一种保守的pre-mRNA加工机制

在SL反式剪接过程中,生物利用SL RNA分子上的SD位点和pre-mRNA分子上的SA位点,在剪接体的作用下,将SL作为小型外显子加到pre-mRNA上形成成熟的mRNA。SL反式剪接这一古老的生物学过程在那些进化缓慢的分子中被完整地保留了下来。不同生物间的SL在大小和组成上有时差别很大;个别生物中还存在着组成完全不同的两种SL,它们在pre-mRNA的加工过程中有着不同的作用。几乎所有的SL RNA在结构上有着惊人的相似之处,包括5’末端的TMG帽子结构、保守的SD位点、Sm位点、SL RNA二级结构等。由于pre-mRNA在转录过程中丢失了SA位点或获得了SD位点,大多数脊椎动物在进化过程中丢失了SL反式剪接方式,而这种丢失可能是导致脊椎动物C值增高的原因之一。

对HCMVUL54 mRNA片段特异性切割的M1GS构建

人巨细胞病毒是一种DNA病毒,在人群中一般呈亚临床感染和潜伏感染。为研究病毒基因沉默工具和抗病毒制剂,以人巨细胞病毒UL54基因mRNA序列设计互补的外部引导序列,共价结合到大肠杆菌来源RNaseP催化核心M1RNA上,从而构建成M1GS-T6核酶。通过对DNA聚合酶UL54基因亚克隆片段转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54mRNA片段的特异切割能力。

HCV特异性M1GS核酶的构建及体外切割活性研究

针对HCV基因组中较为保守的区域—5′UTR,设计一段GS引导序列,并与大肠杆菌RNase P的催化亚基—M1RNA的3′末端共价结合,构建序列特异性M1GS核酶—M1GS-HCV/C20。体外实验证实,所构建的人工核酶对HCV5′UTR具有明显的靶向切割活性,且这种切割发生于靶序列的特定位点。研究将为进一步阐明该核酶在胞内的活性、乃至动物模型内评价其抗病毒效果提供实验材料,从而为新型抗HCV药物及反义基因治疗的研究奠定基础。

rhGH在大肠杆菌周质中的分泌表达

在大肠杆菌周质中分泌表达rhGH既有利于消除其在临床应用上的抗原性又有利于提取纯化,在rhGH的发酵生产中越来越受到青睐。就rhGH在大肠杆菌中的分泌表达机制以及启动子、引导序列、宿主菌、培养基和培养条件对分泌表达效率的影响等方面进行了综述。

GS介导RNase P对人巨细胞病毒ul54基因mRNA的切割作用

引导序列(Guide Sequences,GSs)是与mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段。设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus,HCMV)ul54基因D片段mRNA序列互补的GS,将其共价结合到大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA,构建成T7-M1GS核酶。通过对ul54基因D片段转录产物体外切割实验和将T7-M1GS构建在含有U6启动子的逆转录病毒载体,与构建在真核载体pEGFP-N1的ul54基因D片段共转染人宫颈癌细胞系HeLa的体内切割实验,证实该核酶具备对ul54基因D片段mRNA的特异切割能力,为利用核酶治疗HCMV感染提供实验基础。

RNase P对人巨细胞病毒mRNA的体外靶定切割研究

目的 探讨核酶P对HCMVUL97mRNA的体外切割能力。方法 以人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus ,HCMV)磷酸转移酶mRNA序列为靶设计externalguidesequences(EGS) ,共价结合到大肠杆菌来源M 1RNA中 ,构建成M 1GS-T5核酶。对其进行UL97基因亚克隆片段转录产物的体外切割实验。结果 该核酶在一定离子浓度下具对UL 97mRNA片段产生特异切割能力。结论 新构建得到的核酶MIGS -T5具特异性切割活性 ,可发展为一种抗病毒试剂。

寄生虫的反式剪接研究进展

从锥虫可变表面糖蛋白 ( VSG)中发现反式剪接以来 ,已经发现很多低等真核生物体内都存在这种剪接形式。这种广泛存在于低等真核生物中的反式剪接 ,对于生物蛋白多样性、阶段性表达有着重要的生物学意义。反式剪接中的反式剪接引导序列 ( spliced leader,SLRNA)为一段保守序列 ,SL RNA为寄生虫的功能基因的筛选、c DNA文库的构建提供了表达基因标签 ( EST) ,同时反式剪接为转基因治疗提供了有力的手段。反式剪接的发现和广泛研究 ,对于深入了解低等真核生物的核酸分子生物学及其起源、进化、系统发生、寄生虫病的预防研究等都有着重要意义。文章对反式剪接在低等真核生物体中的研究现状、SL RNA基本结构。

猪带绦虫新基因SLC10的研究

【目的】克隆和表达猪囊尾蚴SLC10基因,明确其组织分布,为寻找猪囊虫病的新型疫苗或诊断候选基因奠定基础。【方法】以绦虫保守的反式剪接引导序列为基础,通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆出来的一个未知基因,将其在大肠杆菌中表达,用亲和层析纯化的重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测和免疫组织化学试验。【结果】将新基因命名为SLC10,其ORF为507bp,编码18.2kD的蛋白,基因组全长1107bp,由两个外显子和一个内含子组成。ELISA结果显示70份囊尾蚴阴性血清和75份囊尾蚴阳性血清都不与重组蛋白发生反应,免疫组织化学实验表明SLC10天然蛋白主要分布在除猪囊尾蚴头节以外的囊壁内部。【结论】SLC10蛋白为非分泌型结构蛋白,与诱导宿主产生抵抗囊尾蚴感染的体液免疫应答无关。

RNase P核酶对人巨细胞病毒UL54基因mRNA体外切割作用

外部引导序列(EGSs)是mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段。我们设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus) UL54基因mRNA序列互补的EGSs,将其与大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA构建成M1GS核酶。通过对UL54基因亚克隆片转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54 mRNA片段的特异切割能力,可以发展成为一种抗病毒试剂。

RNase P体外靶定切割人巨细胞病毒UL54 mRNA片段研究

目的:观察大肠埃希菌RNase P催化亚基M1 RNA在细胞外水平上对人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)DNA聚合酶UL54 mRNA的切割效果,探讨核酶作为新型抗病毒制剂的应用前景。方法:针对HCMVUL54 mRNA设计特异性的外部引导序列(external guide sequences,EGSs)EGS-T6,观察其引导M1 RNA特异的细胞外切割活性。结果:在EGS-T6引导下,大肠埃希菌RNase P催化亚基M1 RNA在细胞外可特异地对靶mRNA进行有效切割。结论:EGS-T6具备引导M1 RNA对UL54 mRNA特异切割的能力,可发展成一种新型抗病毒制剂。

人类核糖核酸酶P的研究进展

人类核糖核酸酶P是具有酶活性的核糖核蛋白复合体。根据靶RNA设计的外部引导序列(EGS)能与靶RNA碱基互补结合,形成类似前体tRNA的二级结构,从而引导人类核糖核酸酶P对靶RNA进行特异切割。因此,基于人类核糖核酸酶P的EGS技术能在mRNA水平抑制病毒及肿瘤靶基因的表达,在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广阔的应用前景。

EGS-C^(67)抑制HCV基因表达及其抗病毒活性的测定

目的基于丙肝病毒(HCV)基因组保守区5'UTR的序列,设计一段相应的外部引导序列(EGS),鉴定其体外靶向切割活性及胞内抗病毒作用。方法用计算机软件对HCV基因保守区的5'非翻译区(5'UTR)序列与结构进行分析,选择针对HCV第67位胞嘧啶C与第68位鸟嘌呤G之间的位点,作为设计的靶位,设计相应的EGS(EGS-C^(67)),将该EGS导入HCV感染的Huh7.5.1细胞,通过Northern blot及Western blot试验检测HCV基因的表达,通过荧光定量PCR检测EGS-C^(67)的抗病毒活性。结果体外切割试验表明EGS-C^(67)对HCV RNA片段具有明显的靶向引导活性。在宿主细胞内EGS-C^(67)可显著抑制HCV基因的表达,可使Huh7.5.1细胞培养上清中HCV的滴度降低约150倍(P<0.01)。结论 EGS-C^(67)作为一种新型抗HCV核酸分子,其成功构建为抑制HCV增殖提供了一种新的抗病毒策略。

MBL基因H/L、P/Q位点多态性与新疆维吾尔族结核病的相关性研究

目的探讨MBL基因H/L、P/Q位点的多态性是否与新疆维吾尔族人群结核病发病相关。方法通过使用引物序列特异性PCR（PCR-SSP）的方法分别对226例新疆维吾尔族活动性肺结核患者及231例有结核分枝杆菌接触史的新疆维吾尔族健康者研究MBL基因的H/L、P/Q多态性位点与新疆维吾尔族人群结核病易感性的关系。结果新疆维吾尔族结核病例组中MBL-H/L突变基因型频率与新疆维吾尔族健康对照组突变基因型频率分别为25.66%、18.18%,差异无统计学意义（OR=1.600,95%CI：1.020～2.511,P=0.040,Pc=0.052〉0.05）。新疆维吾尔族结核病例组中MBL-P/Q突变基因型频率与新疆维吾尔族健康对照组突变基因型频率分别为10.62%、10.82%,差异无统计学意义（OR=0.979,95%CI：0.541~1.797,P=0.050,Pc=0.994〉0.05）。MBL-AB等位基因型与MBL-HL等位基因在病例组的相交系数为0.018,P值为0.006〈0.05。新疆维吾尔族人群MBL-A/B,H/L,P/Q之间测出4个单倍体型：HPA,LPA,LPB,LQA。结论新疆维吾尔族人群中MBL基因H/L、P/Q多态性与结核病易感性无明显相关性。新疆维吾尔族人群MBL-A/B,H/L,P/Q等位基因型之间存在连锁不平衡,MBL-A/B等位基因型与MBL-H/L等位基因有正向交互作用。

A、O型口蹄疫T/B细胞多抗原表位融合基因植物表达载体的构建

通过对(pMD-xsB/xsT/xsBT/xsBTT)4个克隆载体进行PCR,在(xsB/xsT/xsBT/xsBTT)目的基因前接入引导肽序列(用Y表示),克隆中间载体(pMD-xsYB/xsYT/xsYBT/xsYBTT),再利用同尾酶的酶切及连接得到4个重组植物表达载体(pB I-xsYB/xsYT/xsYBT/xsYBTT)。经限制性酶切鉴定和测序分析证实表达载体构建正确,为下一步热研2号柱花草转基因植株的获得奠定了基础。