四步法消除SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响

为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂的 (5s)恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四步法 .PDs的Tm 通常高于 72℃ ,但低于扩增产物的Tm .将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时 ,四步法能够有效地消除PDs的影响 .对三步法和四步法SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR进行了比较 ,发现三步法根本不能用于RNA的实时定量 ,而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量 .选择Tm 值尽可能小的引物 ,使PDs与扩增产物Tm 值之间有足够的差距 ,将更有利于四步法的应用 。

实时荧光定量检测中引物二聚体的优化

实时定量检测中引物二聚体的存在会严重影响检测结果的准确性,本文提出多方面的优化策略,以减少或消除实时定量检测中引物二聚体的集聚。

一种新的引物二聚体形成机制

目的 通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR无模板测试技术,阐明引物二聚体形成的机制,解决PCR反应中引物二聚体形成的问题,推动SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术的应用.方法采用 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测不同特点的典型引物对形成引物二聚体的Ct值,检测特异的反义核苷酸、短寡核苷酸对二聚体的影响,测试优化方案在HBV DNA定量检测中的效果.结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR测试发现,3′端连续6～7碱基反向互补的引物对的Ct值：5.0、10.0、11.0;与另一引物中部连续6个碱基反向互补的Ct值：30.0、28.0、29.5;与另一引物5′末端连续6个碱基反向互补的引物对的Ct值：32.0、29.5、31.0.普通引物对测试的Ct值：27.5、29.0、31.0;中间部分同向相同的引物对测试的Ct值：36.5、43.0、39.0;同向相同的引物对未形成二聚体,反向相同引物对测试Ct值是30.5.低温预处理的短寡核苷酸促进二聚体形成,而在热启动PCR反应中无作用,特异的反义核酸抑制二聚体.PCR增效剂推后普通引物对的二聚体1个循环,推后部分同向相同的引物对的二聚体10个循环.中间部分相同的引物对检测低浓度质粒标准品比普通引物对检测结果更精确.结论 提出一种新的引物二聚体形成机制：引物对在3′末端碱基反向互补结合的基础上,借助剩余序列的同向互补力量拉近彼此在空间上的距离,从而进行延伸反应形成引物二聚体.中间偏3′端同向相同的引物对可以有效抑制引物二聚体,并且该作用可以被其他优化方法加强.

引物二聚体在目的基因克隆中的应用初探

目的 根据引物二聚体形成原理 ,建立一种新的克隆目的基因的方法。方法 人工合成两条或两条以上 3′端互补配对的寡核苷酸链 ,寡核苷酸链、Taq酶和dNTP按一定比例混合 ,PCR扩增延伸 ,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。结果 PCR产物经电泳鉴定 ,可见一条清晰的特异条带。结论 此方法能合成 5 0 0bp以下的短片段目的基因。

一种去除聚合酶链式反应引物二聚体的简便方法

目的提供一种去除聚合酶链式反应(PCR)引物二聚体的简便方法。方法根据聚乙二醇(PEG)能够选择性沉淀DNA片段的原理,确定分别去除100 bp、100～200 bp、100～300 bp条带的PEG 6000最终质量分数,因引物二聚体大小一般为200 bp,最终运用到去除含有引物二聚体的PCR产物中。结果最终质量分数为10.67%、9.00%、8.00%的PEG能分别除去100 bp、100～200 bp、100～300 bp条带。最终质量分数为24.00%的PEG能有效去除PCR引物二聚体并纯化PCR产物。结论 PEG 6000能有效去除PCR扩增产物的引物二聚体,达到纯化PCR产物的效果。

福尔马林固定石蜡包埋标本二代测序终文库去除引物二聚体的方法

二代测序(next generation sequencing,NGS)技术能够同时对上百万乃至数十亿个DNA分子进行测序,相较于传统测序技术,其速度较快、一次可检测大量靶基因,因而广泛应用于染色体非整倍体无创产前筛查、肿瘤靶向治疗基因突变检测、遗传性肿瘤检测、病原微生物及宏基因组检测等领域。影响NGS结果的限制性因素包括:平台类别、靶区域富集方法、文库构建及扩增效率、测序数据量、生物信息学分析流程等。NGS流程主要包括3个部分:文库制备、测序和数据分析,建库是NGS实验第一步,终文库质量的好坏直接影响后续测序仪上机实验及数据分析。

PCR过程中生成引物二聚体回收再利用的研究

目的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)过程中生成的引物二聚体(Primer Dimer,PD)回收再利用。方法重组质粒pET28a(+)-ProDer f 1转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,以ProDer f 1基因特异性引物PCR验证阳性菌落,PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收菌落PCR过程中生成的引物二聚体,分光光度计260nm检测回收产物浓度;以重组质粒pET28a(+)-ProDer f 1为模版,不同浓度的回收产物为引物进行PCR扩增,产物行1%琼脂糖凝胶电泳,目的条带切胶回收并测序。结果回收产物为引物的PCR产物,在1000bp处出现特意条带,其核苷酸序列与ProDer f 1基因特异性引物PCR产物序列一致。结论 PCR过程中生成的引物二聚体可以作为特异性引物回收再利用。

分子信标-TaqMan探针法实时荧光定量PCR新型探针及引物

在TaqMan探针法实时荧光定量PCR中,排除由引物探针聚合延伸引起的假阳性问题以及由引物二聚体(Primer Dimer,PD)引起的假阴性问题。首先对不同探针进行引物探针聚合实验;然后通过双重PCR的干扰实验选择合适的内标基因,并使用内标质粒检测验证中部同序引物排除PD干扰的实用性;最后比较探针法不同体系检测HBV基因的灵敏度。结果表明,引物与探针聚合实验中,含有反义碱基的HBVP4在重复实验中未出现假阳性;竞争性双重PCR和非竞争性双重PCR两模板开始出现干扰作用的浓度差分别为20倍和100倍;对于内标基因,使用中部同序引物对以及普通引物对分别可以检测到10-9和10-8稀释度;3种HBV基因检测体系,使用普通引物对可以检测到Ct33左右,加入内标系统和使用中部同序引物对均可检测到Ct35左右。在TaqMan-分子信标结构调整的基础上引入反义碱基可以在排除由引物和探针聚合延伸引起的假阳性问题;在探针法中,使用中部同序引物对和加入内标系统均可降低PD的干扰程度,提升检测的灵敏度。

ARMS实时PCR基因分型特异性的研究

以原癌基因Kras基因12位密码子的4种基因型(野生型为GGT,突变型为AGT、TGT、CGT)质粒DNA为研究模型,采用SYBRGreenⅠ为实时PCR指示剂,进行ARMS实时PCR基因分型特异性的研究.结果表明:在和模板匹配的ARMS引物3′端附近引入故意错配碱基,将ARMS引物浓度稀释10倍,并对传统三步PCR循环进行改良,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异,在传统延伸步骤之后增加一步恒温80℃检测荧光步骤,可消除引物二聚体的影响,使ARMS引物的特异性增强,得到清晰的基因分型结果.实验表明这种基于SYBRGreenⅠ的ARMS实时PCR基因分型方法,无需合成探针,实验设计简单,是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法,可推广用于其他基因的分型,并可望成为应用于临床的基因诊断技术之一.

PCR的优化与发展

实时荧光定量PCR亦成为RT-QPCR的出现,确定了PCR(聚合酶链)反应的技术实现由了定性检测到兼定量检测靶标核苷酸序列的华丽变身,是对PCR质变式的优化,但是该技术在现实应用中依然存在着大量的难以克服的障碍:分析溶解曲线的过程耗时很长、标记任意荧光探针的费用昂贵、非特异性的扩增干扰等,长时间来都阻碍着RT-QPCR的技术应用。迄今,PCR中隐含的这些难题的具体机理仍未被彻底弄明白,所以无法从彻底被消除,因此多种优化PCR的技巧需要被采纳以推动应用方面和在其有关的领域的研究发展。因此,PCR技术中有关优化方案的研究发展迅速,这不仅仅能够提高PCR方法的扩增效率,还能有针对性地抑制非特异性扩增,PCR定量分析、检测技术的适用范围被无限推广,而且对于分子生物学的核心技术的发展而言也有利于其顺利地发展。本文就目前对PCR优化与发展的近期进展进行了论述和展望。

实时荧光定量PCR非特异性分析

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)因灵敏度高、操作简便在各个领域得到了广泛的应用。然而,伴随其高灵敏度存在的非特异性问题在一定程度上限制了其应用。不同于普通检测方法,该技术的非特异性问题主要由可以指数扩增的引物二聚体(primer dimer,PD)引起。对此,引物设计时使用的中部同序引物对可以从根本上避免PD的产生,从而解决由其引起的非特异性问题。该文从PCR的发展和本质、PCR非特异性产生的原因和应对策略等方面作一总结及分析。

影响内标双重PCR靶模板检测灵敏度的因素分析

目的在内标双重PCR系统中寻找影响靶模板检测灵敏度的主要因素,并比较不同检测体系的灵敏度。方法针对HBV基因设计普通引物对和中部同序引物对,比较引物二聚体（PD）含量;控制内标基因的Ct值约为30,调整内标引物浓度为10、8、5、2、1μmol/L,比较不同体系的检测灵敏度;控制内标引物的用量不变,分别测定内标基因Ct值在15、20、25、30时的靶模板检测灵敏度。结果中部同序引物PD的Ct值在35以上,普通引物对PD的Ct值在30~33之间;10、8、5、2、1μmol/L浓度的内标引物需要内标模板的浓度分别为5×10^4、5×10^4、5×10^4、5×10^5、5×10^7IU/m L;不同内标引物用量检测灵敏度均为5×10^3IU/m L,仅使用中部同序引物的单重PCR检测灵敏度为5×10^2IU/m L;内标Ct值在15、20、25、30时靶模板检测的灵敏度分别为5×10^5、5×10^4、5×10^3、5×10^3IU/m L。结论在双重PCR检测体系中,对靶模板检测灵敏度影响最大的因素为内标的模板量,仅使用中部同序引物对的单重PCR具有最高的灵敏度。

TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展

TaqMan探针法实时荧光定量PCR因其重复性好、特异性强、线性范围宽等特点在各个领域有着广泛的应用,内标系统的引入进一步提升了该方法的灵敏度,增加了其可靠性和实用性。然而,这一技术也因为假阴性和假阳性问题存在着改进的空间。本文从TaqMan探针法的简介、研究进展以及应用前景展开综述。

SYBR Green I Realtime PCR检测胃癌组织中LIN28基因方法的建立

目的建立SYBRGreen I荧光染料实时定量PCR方法，测定LIN28基因在胃癌组织中的表达水平，并进行实验室方法学评价。方法采用RT—PCR扩增LIN28基因片段，将该片段克隆到质粒载体PMD18-T上，转化入大肠埃希氏菌（DH5a）中，PCR鉴定后，提取重组质粒，以阳性质粒为模板，建立SYBR—GreenI荧光定量PCR标准曲线，以pactin为内参，运用Rotor—Gene6000seriessoftware做相对定量分析，检测30例胃癌患者的癌组织中LIN28的表达水平。结果用重组质粒制作的标准曲线循环阂值与模板浓度有良好的线性关系，内参pactin和LIN28标准曲线相关系数分别为0．9997和0．9991，其最低的检测拷贝数为1，LIN28溶解曲线呈单个特异峰。结论成功地构建了LIN28的原核表达载体。建立的SYBRGreenI荧光染料实时定量PCR法特异度、敏感度高，稳定性好，可用于定量测定胃癌组织中LIN28的表达水平。