基于引物延伸反应进行SNP基因分型的电化学方法

引物延伸反应的高特异性使其成为单核苷酸多态性(SNP)基因分型的最常用方法.本文利用引物延伸反应,通过二茂铁标记的dUTP将二茂铁引入到延伸的产物中,用一条捕获探针将延伸产物捕获到电极表面,用差分脉冲伏安法对电极表面的二茂铁进行检测,从而实现了SNP基因分型.考察了延伸反应的退火温度、聚合酶用量以及DNA杂交温度等因素的影响.应用该方法对β-地中海贫血基因密码子28位单碱基突变进行检测,获得了满意的基因分型结果.该方法检测限可达到0.86fmol/L,是一种简便、快速且灵敏的SNP分型方法.

液相芯片技术联合等位基因特异性引物延伸反应检测结核分枝杆菌耐多药突变

目的建立一种耐多药结核分枝杆菌检测方法。方法设计并构建含有kat G315、rpo B526、rpo B531耐药基因突变位点的质粒;通过PCR扩增及纯化、等位基因特异性引物延伸反应（ASPE）、荧光微球杂交反应及液相芯片系统Luminex 200检测;并对该方法反应条件进行探索及方法学评价。结果 ASPE反应中Tsp DNA聚合酶最适浓度为0.025 U/μL,杂交荧光微球浓度为每μL 100个,链霉亲和素藻红蛋白浓度及杂交时间分别为2μg/m L和20 min;所建立方法的检测灵敏度最低可达1ng/m L;当质粒浓度为1.5×105ng/m L时,批间和批内变异系数（CV）分别为6.48%～12.15%和0.35%～6.92%;当质粒浓度为2 ng/m L时,批间和批内变异系数（CV）分别为5.73%～10.77%和0.97%～8.91%;特异性引物探针与其他突变位点均无交叉反应。结论液相芯片技术联合等位基因特异性引物延伸反应检测耐多药结核分枝杆菌灵敏且具有成本低、高通量等特点,极具临床应用潜力。

基于性别连锁SNP特异性引物延伸反应的斑点叉尾■遗传性别鉴定方法的建立与应用

为建立一种准确和快速鉴定斑点叉尾■遗传性别方法,根据其性别连锁SNP(single nucleotide polymorphism)位点,设计外围引物、SNP特异性延伸引物和DNA探针。性别连锁SNP特异性引物延伸反应结束后,将扩增终产物与DNA探针杂交,并应用基于免疫胶体金技术的核酸检测试纸检测性别连锁SNP,从而实现遗传性别分子水平的可视化鉴定。结果显示,该方法能够准确地鉴定斑点叉尾■的遗传性别,与基于性别连锁微卫星标记的遗传性别鉴定方法所得结果一致,表明斑点叉尾■性别连锁SNP特异性引物延伸反应联合基于免疫胶体金技术的核酸试纸能够准确、快速地完成斑点叉尾■的遗传性别鉴定。

基于PCR和位点特异性引物延伸反应的SNP检测方法的建立

目的建立一种基于聚合酶链反应(PCR)、位点特异性引物延伸反应(ASE)和核酸试纸条检测技术的单核苷酸多态性(SNP)检测方法。方法先通过PCR对包含SNP位点的特异基因序列进行扩增;然后通过带有A标记的ASE引物针对SNP位点的不同基因类型进行特异性延伸;延伸后的产物可以与B标记的探针进行杂交结合,形成同时携带A和B标记的杂交产物;而该杂交产物可以通过核酸试纸条进行目视化检测,从而完成对SNP基因型的检测。结果通过对10倍浓度梯度稀释的人类基因组DNA进行检测,PCR-ASE的检测敏感性为88 ng/反应;通过在同一条核酸试纸条上针对同一SNP位点2种不同基因型的检测,达到了多重检测的目的;PCR-ASE对19名志愿者的5个不同SNP位点的检测结果与基因测序法完全一致。结论 PCR-ASE是一种简单、准确的SNP基因型检测方法。

基于引物链延伸反应的基因传感器的研究

依据晶体谐振频率是其表面沉积物的函数和模板-引物杂交后引物链延伸的酶促反应原理,构建了引物链延伸反应性基因传感器技术.该技术的主要特点是以快速、敏感的频变信息作为基因杂交与引物链延伸的显示系统.研究结果提示,本项技术可用于核酸同源性分析、微量DNA检测、DNA整合性的确定,也可用于目的基因的分离、特定条件下的基因突变分析及推断某基因在其基因组中的位置.