引物悬挂延伸PCR扩增白藜芦醇合酶cDNA

为了得到葡萄白藜芦醇合酶 RS 基因的 c DNA,实验以葡萄叶片为材料 ,利用引物悬挂延伸 PCR法 ,以葡萄总 DNA为模板 ,先分别扩增得到编码白藜芦醇合酶的第一外显子和第二外显子的序列 ,再以这两个序列为模板 ,进行第二轮的 PCR,得到大小与 RS基因大小相同的片段 ,经 PCR产物测序证明 ,两个外显子已经准确无误地拼接 ,此片段就是 RS基因 .

以PCR为基础的定点诱变方法研究进展

以PCR为基础的定点诱变技术是近年来得到极大发展的分子生物学方法,不仅用于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究,还用于定点改造目的基因。综述了以PCR为基础的定点诱变的各种方法,并介绍了国内外最新的研究进展,重点介绍并分析了单管大引物法、一步重叠延伸PCR、多位点环状诱变PCR及TAMS定点诱变等新方法,比较了不同方法的优缺点,分析了存在的问题并提出解决对策。

新的有性PCR法

Affymax研究所的Willem Stemmer提出了一种作为产生基因突变体文库并使之经受自然选择压力的技术的“有性聚合酶链反应(Sexual PCR)”法。Stemmer制备了β-内酰胺酶基因突变体并通过有性PCR产生了抗生素抗性水平比原始克隆高16000倍的克隆。 PCR是一系列DNA复制循环,包括三个步骤:使DNA链解离的变性作用、使引物寡核苷酸与解离链杂交的退火、及使引物延伸的聚合作用。复制分子从最初群体开始向下遗传的情况可由分枝树表示,每一分枝点代表在变性步骤中的两链分离。事实上,聚合作用的中断或早熟都会导致错误。

花生白藜芦醇合酶基因cDNA的克隆及植物表达载体的构建

为得到含有白藜芦醇合酶cDNA(RS cDNA)并能表达白藜芦醇(Res)的转基因植物,以花生为材料,从其根部提取基因组DNA,并以其为模板,利用引物悬挂延伸PCR法扩增得到大小约1200bp的片段,将这个片段连接到克隆载体PBS-T上进行测序,测序结果证明,此片段就是花生的RS cDNA。将此片段再正向插入到植物表达载体PBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,对重组子进行筛选与鉴定,证明花生的RS cDNA已经正确插入PBI121中,成功的构建了植物表达载体PBI121L。

变性高效液相色谱快速诊断儿童型脊肌萎缩症

目的 建立变性高效液相色谱(denaturinghighperformanceliquidchromatography, DHPLC) 快速诊断儿童型脊肌萎缩症(spinalmuscularatrophy, SMA) 的新方法。方法 (1)用二重聚合酶链反应(PCR) 扩增运动神经元成活基因(survivalmotorneurongene, SMN) 外显子7、8及周围部分内含子序列; (2) 纯化PCR产物以除去其中的引物、dNTP及缓冲液中的盐粒子等成分; (3) 采用多重引物延伸反应特异性检测能将SMN1基因与SMN2基因区分开的3个特异性位点; (4) 将延伸反应的产物用DHPLC在完全变性的条件下分析。结果 将建立的新方法与传统的PCR-酶切法进行盲法对比试验, 检测了30例标本(包含20例SMA患儿和10例正常人群外周血基因组标本) 以验证新方法的特异性和可靠性, 其诊断结果与PCR-酶切法结果完全一致。结论 多重引物延伸反应结合DHPLC分析技术是一种可用于临床SMA基因诊断、产前诊断及胚胎种植前遗传学诊断的高效、灵敏、可靠、快速、简便的新方法。

嗜线虫致病杆菌Xna基因同源重组载体的构建及遗传转化体系的建立

构建嗜线虫致病杆菌Xna基因的同源重组载体和建立该细菌的遗传转化体系。扩增嗜线虫致病杆菌XNA基因的左右同源片段及质粒PEASY-T1上的卡那抗性基因Km;利用重叠延伸引物PCR法将这3个片段连接起来,然后将其克隆至自杀性载体PJQ200。采用电激法将同源重组载体DNA转化到供体细菌,再利用二亲本结合转移方法将供体细菌中的载体转化到受体细菌CB6菌株。结果成功地扩增了Xna基因的左右同源臂及卡那抗性基因的全长融合片段、构建了Xna基因的同源重组载体,并建立了嗜线虫致病杆菌北京变种的遗传转化体系。