靶向鉴别、检测动物双歧杆菌的引物探针及应用

为解决目前应用于鉴别动物双歧杆菌的方法的用时长、操作复杂、实验环境低适配性等缺点,开发了一种基于ERIC-PCR技术设计特异性引物探针以靶向鉴别、检测动物双歧杆菌的方法。以动物双歧杆菌HP-B1124基因组DNA为基础,优化动物双歧杆菌HP-B1124的ERIC-PCR反应条件,对ERIC-PCR片段逐一回收并进行测序,针对测序结果设计两对特异性引物探针,对两对引物探针设计结果的准确性、特异性、可检测基因组DNA的含量限度、普适性进行检验,并运用所设计的两对特异性引物探针检验市售公示配方中含有动物双歧杆菌的产品。本研究设计的两对特异性引物探针可简单、快速、靶向的用于动物双歧杆菌的鉴定。此方法优化了目前相对传统的动物双歧杆菌纯培养及平板计数鉴定方法,一定程度上解决了SNP基因分型技术及实时荧光定量PCR法等方法在鉴定动物双歧杆菌方面对实验设备及试剂的高要求,具有成本低、特异性强的特点,有较为广阔的市场开发前景。

特异性检测干酪乳杆菌的引物探针设计

目的:基于肠杆菌科基因间重复共有序列聚合酶链反应(Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR,ERIC-PCR)技术,设计特异性引物探针,实现干酪乳杆菌的靶向检测。方法:以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HP-B1142为研究对象,通过不同实验,优化干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的ERICPCR反应体系。通过凝胶电泳获得特定的条带,对其进行测序和分析,设计出特异性的引物探针,达到对干酪乳杆菌靶向鉴别的目的。结果:通过不同实验,得到干酪乳杆菌的最佳ERIC-PCR反应体系;基于干酪乳杆菌ERIC基因片段,获得两对特异性引物,可在多种DNA的混合溶液中快速靶向鉴别出干酪乳杆菌。结论:基于ERIC-PCR技术获得的特异性引物探针,可高效、灵敏地实现复杂生境中干酪乳杆菌检出。

基于茎环引物探针法定量检测乙型肝炎病毒miR-3的方法学建立

目的:本研究拟通过广泛筛选特异性引物探针组,建立一套乙型肝炎病毒(HBV)微小RNA-3(miR-3)的绝对定量PCR检测方法。方法:基于茎环引物RT-qPCR方法原理,设计茎环引物进行逆转录,结合SYBR Green法qPCR进行特异性初筛,选择特异性较佳的引物组,再结合TaqMan MBG探针,确定最佳的引物探针组,实现对HBV miR-3的定量检测。结果:共设计和测试了25套茎环引物组,利用基于SYBR Green的RT-qPCR方法,筛选出6套具有良好特异性的引物组,并进一步针对这些引物组设计和测试了相应的探针,获得了可精准定量HBV miR-3的引物探针组。测试结果表明,该引物探针组不但保证了高特异性,而且定量线性范围达到每个反应102~108拷贝,其扩增效率约为88%。结论:本研究确立了一套可用于绝对定量检测HBV miR-3的特异性引物探针组。

特异性检测、鉴别乳酸片球菌的引物探针及其应用

为解决现有方法在检测乳酸片球菌时表现出耗时长、检测不灵敏的缺点,拟制备并运用2对特异性引物探针快速准确地从复杂生境中检测乳酸片球菌。提取乳酸片球菌HP-B1099基因组DNA,通过4因素3水平正交实验寻找ERIC-PCR最佳反应程序,并得到乳酸片球菌有代表性的2条ERIC基因片段,设计获得2对引物探针1099-750-F/1099-750-R、1099-3-F/1099-3-R,并对2对引物的特异性、普适性、检测限度进行验证与检验。结果表明:基于ERIC-PCR技术设计的2对引物探针,可简便快速地实现混合样本中乳酸片球菌的检出,具有特异性、普适性的特点,并在多达8种基因组DNA或8种菌株混合样本中特异性地鉴别痕量乳酸片球菌,最终实现在多株近缘菌株或复杂生境中检出极低浓度的乳酸片球菌。

特异性检测鼠李糖乳杆菌的引物探针及应用

[目的]基于ERIC-PCR技术设计引物探针,用于鼠李糖乳杆菌的特异性检测,探究引物探针的属性特征。[方法]以鼠李糖乳杆菌HP-B1083为研究对象,利用新型ERIC兼并引物与4因素3水平正交实验获得鼠李糖乳杆菌ERIC指纹图谱,根据鼠李糖乳杆菌ERIC序列设计特异性引物探针,并进行引物探针特异性、普适性及检测限度验证。[结果]使用ERIC-PCR技术获得的鼠李糖乳杆菌ERIC指纹图谱,成功设计了4对针对鼠李糖乳杆菌的引物探针。探针能在8种混合益生菌中特异性检出鼠李糖乳杆菌,能高效检出6株鼠李糖乳杆菌的同源菌株,在DNA为27 ng/mL的混合基因组中亦可实现鼠李糖乳杆菌的痕量检出。[结论]设计的4对引物探针能实现鼠李糖乳杆菌的特异性检出,具有高特异性、宽广谱性、强灵敏性的特征,实现DNA为27 ng/mL的混合基因组中鼠李糖乳杆菌的痕量检出,具有良好的探针属性特性。

双引物探针RT-Realtime PCR检测马铃薯A病毒

马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)是我国重要的检疫性有害生物。本研究根据PVA中CP基因(coat protein gene)的保守序列,设计了两套PCR引物和TaqMan探针,建立了双引物探针RT-RealtimePCR检测PVA的方法。该方法采用实时荧光PCR技术,有效地提高了检测的灵敏度;同时两套引物探针相互验证,有效提高了结果的准确性。实验结果表明,本方法准确、灵敏、简便、快速,检出低限可达0.5fg/μL植物总RNA。

应用引物-探针能量转换系统(PriProET)实时荧光定量PCR技术检测猪圆环病毒2型的研究

研究应用实时荧光定量PCR技术(以引物-探针能量转换系统(PriProET)为基础)检测了猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV2是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PM-WS)的重要病原,与其它疾病如猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的发病密切相关。由于PCV2通常发生在猪群中,而且该病的严重程度与器官、血液中的病毒载量有关,因此检测病毒载量也可反应出PCV2的严重程度。为了确定临床症状和不同器官病毒载量的相关性,本试验应用PriProET RT-PCR技术对PMWS的各种病毒及其临床症状进行了研究。试验结果表明,所测数据与前人研究结果相一致,即患PMWS的情况下,1 mL血浆和500 ng组织中DNA的病毒载量均大于107拷贝数。因此,新的PriProET RT-PCR技术可用于检测PCV2,并且具有特异、灵敏和稳定的优点。

不同方式标记非放射性探针原位杂交效果评价

目的比较不同方式标记非放射性探针的原位杂交效果。方法通过两种方法标记地高辛随机引物DNA探针和反意RNA探针,在大鼠损伤模型的皮肤组织上进行原位杂交。结果两种探针均可满足要求,以反意RNA探针在阳性染色深度和背景方面效果更佳。结论RNA探针在杂交效果方面优于DNA探针。

多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用

目的：建立与应用多种探针的 RT-PCR分析 H5N1病原体的检测方法体系。方法通过 GenBank发表的基因序列分析，针对保守区分别设计并合成2对特异性引物（P1/P2，P3/P4）。通过对扩增条件的优化，建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法。结果合适引物浓度：P1/P2为0.32μmol/L，P3/P4为0.96μmol/L。双重检测的最小病毒核酸量为2 ng/μl，H5N1病原体混合液在相对应位置出现特异性条带，而其他病毒及空白对照均未出现条带。结论多种探针的RT-PCR分析对于 H5N1病原体检测方法在合理引物浓度的应用下具有很好的敏感度与特异度，值得在检验中推广应用。

多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用

目的:探究多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用。方法:分析Genbank数据库的基因序列,针对保守区分别设计并合成两对特异性引物(P1/P2,P3/P4)。通过对扩增条件的优化,建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法。结果:合适引物浓度为P1/P2为0.32μmol/L,P3/P4为0.96μmol/L。双重检测的最小病毒核酸量为2ng/μl,H5N1病原体混合液在相对应位置出现特异性条带,而其他病毒及空白对照均未出现条带。结论:多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体具有敏感性高、特异性强等优点,对于禽流感的预防和控制具有积极的作用。

一种副干酪乳杆菌快速鉴定方法的建立及应用

目的:基于肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR),寻找并制备一对引物探针,灵敏、准确地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。方法:寻找副干酪乳杆菌HP-B1145的肠杆菌基因间重复一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC)最佳反应体系,对ERIC片段回收纯化得到特定条带及序列结果,据此设计引物,快速鉴定副干酪乳杆菌。结果:根据回收得到的副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC片段,设计出了一对引物探针(1145-S-F:5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’;1145-S-R:5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’)。结论:根据引物特异性、准确性、普适性、含量限度实验得出,设计的引物能准确灵敏地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。

一种适合中国地区HBV流行特征的荧光定量PCR检测方法的初探

目的设计1套适合中国地区HBV流行特征的高灵敏度、高特异性的HBV引物探针,建立HBV荧光定量检测的方法。方法在NCBI的Nucletide中输入HBV、China、complete genome等关键词找到中国地区的HBV序列,经比对后在保守序列设计引物探针,引物扩增的PCR产物经PMD-19载体连接制备成质粒标准品并测序验证序列,计算质粒拷贝数,将质粒标准品稀释成不同浓度的质粒标准品,用第三方标准品对质粒标准品做校正,绘制HBV标准曲线,并用Probit分析计算检测下限,验证灵敏度、特异性等。将所建立的HBV荧光定量检测方法检测100例标本,并与罗氏cobasTaq Screen MPX Test,version 2.0检测试剂盒检测结果做相关性分析。结果引物探针特异性好,质粒测序结果与目的产物完全吻合,质粒标准品曲线R^2>0.999,扩增效率为95.43%,线性范围(2×10~2-2.5×10~9)IU/m L,95%检测下限为16.2 IU/m L,批内重复变异系数为0.15%-1.11%,批间变异系数为0.91%-4.67%。与罗氏检测结果相关性高(R=0.96)。结论成功设计出1对适合中国HBV流行特征的引物探针,所建立的HBV荧光定量检测的方法灵敏度高、特异性好、重复性好,为在对中国地区开展血液HBV DNA载量检测及监控提供了技术支撑。

亚洲柑橘黄龙病的实时荧光PCR检测方法比较研究

柑橘黄龙病号称柑橘的“癌症”,早发现、早诊断是防止该病蔓延的重要手段。近年来发展了一系列针对该病的实时荧光PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法,但方法间的比较研究尚无报道。本研究以感染亚洲黄龙病的柑橘叶片为材料,对6组柑橘黄龙病qPCR检测所用引物探针进行比较,包括特异性和检出限及在数字PCR(digital PCR,dPCR)中的适用性。结果显示,这6组引物探针对黄龙病的检验特异性良好;灵敏度稍有差别,依次为Las>CLIB 11=CLIB 9>CLIB 12>CLIB 4>rpll;CLIB 9在dPCR反应中相对于其他引物雨滴现象严重,因此不宜选取做后续实验。Las、CLIB 11都适用于dPCR反应,相比之下CLIB 11热图略好一些。本研究为今后黄龙病鉴定方法的选择提供了参考。

光学表面等离子共振生物传感器检测小麦转基因的研究

采用在镀金芯片上修饰一层带巯基的DNA探针引物,构建了一种简单、快速、灵敏的光学表面等离子共振DNA生物传感检测系统.通过监测转基因片段探针引物与目的片段结合时响应信号的变化获得被检物质的浓度,建立了转基因检测标准曲线.最低检测限达0.27 mg·L-1.

通用真菌引物和探针检测人全血标本中侵袭性真菌DNA载量的方法

目的建立实时定量PCR（RQ-PCR）以真菌通用引物和探针快速准确检测人全血标本中侵袭性真菌DNA载量的方法，并与细菌相鉴别及进行初步临床应用。方法选择临床常见的真菌基因组多拷贝基因5.8S rDNA作为靶基因设计特异性通用真菌引物和TaqMan探针，采用QIAamp血液DNA小提试剂盒提取多种致病真菌基因组DNA，建立20 μl RQ-PCR反应体系，对含有不同载量致病真菌的模拟人全血标本和71份外科发热患者全血标本进行侵袭性真菌基因组的定量检测。结果本方法的特异性良好，检测限为101拷贝/μl上机待测液 （即约105 拷贝/ml 全血）；检测灵敏度和特异度分别为95.5%和97.6%，阳性预告值和阴性预告值分别为98.7%和92.0%；标准曲线R2在0.9931~0.9977；批内及批间平均变异系数分别为（10.4±4.0）%和（27.9±2.0）%；人血标本中真菌基因组DNA平均回收率为（91.0±7.6）%，相对回收率平均变异系数为（14.9±4.0）%。71份外科发热患者血标本中未检测出侵袭性真菌基因组。结论RQ-PCR可以借通用真菌引物和TaqMan探针快速、特异、灵敏地定量检测人血标本中侵袭性真菌DNA的载量并可与细菌相鉴别，且有着较好的准确度与精密度。外科发热患者血中侵袭性真菌基因组的存在率可能很低。

啤酒污染菌快速检测鉴定技术的开发与应用

本研究针对啤酒酿造过程污染微生物传统培养技术检测时间长、结果严重滞后的现状，围绕提高检测效率、加强微生物监控能力而进行的基因芯片技术与快速培养技术的创新与开发。通过对啤酒有害菌、好氧菌＋肠道致病菌两种啤酒行业专用基因芯片的开发，达到了在6～8小时内完成96个样品的12种啤酒有害菌、3个属的好氧菌和3种肠道致病菌的同步检测和鉴定；通过采用v向应面试验设计方法对传统MRS培养基进行的优化、改良，将使啤酒有害菌的检测时间从原来的7天缩短到2天，解决了以往检测片球菌属所遇到的生长缓慢、菌落微小、甚至不生长的难题。将以上两种检测技术有机结合，为啤酒生产建立了一套经济、快速、高效、全面的微生物污染预防控制体系，避免了检测结果滞后带来的质量问题和经济损失。

家蚕传染性软化病病毒荧光定量PCR检测技术及浙江省流行病学调查

荧光定量PCR检测技术可实现对病原微生物的早期或快速检测,根据家蚕传染性软化病病毒(BmIFV)的RNA序列,设计了具有物种特异性的引物和探针,建立了荧光PCR检测BmIFV的方法。将设计的引物和探针同时对BmIFV、家蚕微孢子虫(Nb)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、家蚕浓核病病毒(BmDNV)和桑叶进行特异性验证,结果显示只有BmIFV得到阳性结果。该方法对含BmIFV目标片段质粒的检测灵敏度达10^(-3)ng/μL,对目标病毒的检测灵敏度为3.4ng/μL。同时,对浙江省嘉兴市秀洲区、湖州市南浔区、嘉兴市桐乡市、嘉兴市海宁市、杭州市淳安县5个蚕区家蚕感染BmIFV情况进行了流行病学调查,结果显示这5个蚕区BmIFV感染率约为3.6%,为浙江省家蚕传染性软化病防治提供参考。

双引物一条探针的实时荧光RT-PCR检测葡萄卷叶病毒3

葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3)被认为是葡萄卷叶病最重要的致病因子。本研究根据NCBI核酸数据库中葡萄卷叶病毒3复制酶基因序列保守区,设计合成2对上下游引物和1条Taq Man探针,组成2套反应组合。以病毒RNA反转录合成的c DNA为模板,依据2组引物序列和相同的Taq Man探针序列,在荧光PCR特异性、灵敏度、扩增效率对比试验的基础上,建立了双引物一条探针的实时荧光RT-PCR检测GLRaV-3的新方法,病毒RNA检测下限可达4.5 fg/μL。两套组合相互验证,减少非特异性扩增,进一步提高了方法的特异性。