不对称PCR的引物浓度优化及在柑橘基因型分析上的应用

对柑橘不对称PCR的引物比例浓度进行优化筛选,并以不同柑橘品种的基因组片段为模板验证不对称PCR在柑橘品种基因型分析中的可行性。结果表明,不对称PCR双侧的引物最佳浓度因引物不同而不同,当浓度为10∶1时均能达到理想效果,可见不对称PCR可以用于柑橘基因型分析。

基于介观量子理论的最佳PCR引物浓度计算

对PCR反应体系而言,引物浓度过高或过低对反应体系都存在严重的影响,只有合理的浓度区间才能对整个反应高效有序地进行发挥重要的作用.降低PCR引物间的量子效应有利于提高引物间PCR反应的独立性和确定性,故粒子自由程至少是相位关联长度的10倍,并由此可以得到引物反应浓度的上限;粒子非弹性散射的最大自由程是粒子运动的极限自由程,依此可以得到引物反应浓度的下限,从而确定了引物的有效浓度区间;引物浓度-扩增效率曲线一般呈单峰分布,利用黄金分割法可以精准、迅速地确定引物最佳浓度。基于上述计算方法,长20、25、30 nt的引物有效浓度区间分别为0.027~5.280、0.019~7.310、0.015~9.461 umol·L-1。引物有效浓度区间及最佳浓度对PCR反应体系的反应效率与速率、PCR产物质量等具有决定性的作用,而应用理论方法确定它们将对理论指导实验具有重要的意义。

杧果TRAP标记反应体系的优化与引物筛选

为了建立杧果目标区域扩增多态性（TRAP）标记技术体系，对影响该反应体系的Mg2＋、dNTPs、固定引物浓度、随机引物浓度以及TaqDNA聚合酶等5个因素进行优化。

小麦雄性不育材料RAPD扩增体系研究

以光敏雄性不育系A31及其恢复系1376为材料,使用美国MGREACHE公司生产的PTC-200型PCR,对影响RAPD扩增的因素进行了比较研究,确定了模板、Mg2+、dNTPs、引物和TapDNA聚合酶的适宜浓度和最佳的循环次数,实验结果表明在25μL反应体系中使用20～40ng的模板DNA,1.5～2.0mmol/L的Mg2+,0.3～0.4mmol/L的dNTPs,0.15～0.20μmol/L随机引物,1.0～1.5单位TaqDNA聚合酶;反应条件为94℃预变性5min,然后进行94℃45s,36°45s,72°90s,45个循环后,再在72℃延伸10min,小麦雄性不育材料RAPD扩增效果较好。

PCR构建融合基因方法的建立

以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术——融合PCR技术是一种新的基因片段融合技术。以含有马铃薯块茎两种淀粉合成关键酶ssⅡ和ssⅢ基因为模板,利用融合PCR对其进行融合拼接,初步建立以PCR产物(不回收)及一步PCR法融合基因的构建方法,并对融合基因构建时PCR产物(不回收)的使用量及一步PCR法构建融合基因的中间引物浓度等条件进行优化。结果表明,以不回收的PCR产物为模板构建融合基因时PCR产物(不回收)的使用量在10-20 ng范围内为佳;一步PCR法构建融合基因的中间引物浓度在25-1 000 nmol/L为宜。

山羊RAPD反应条件的研究

以贵州山羊为材料 ,研究了MgCl2 浓度、引物浓度、dNTP浓度、模板DNA用量、TaqDNA聚合酶用量对RAPD反应的影响 ,建立了一套适合山羊的最佳RAPD反应体系。反应总体积为 2 5 μl ,MgCl2 浓度 2 .0mmol/L ,引物为 1 8.75ng ,dNTP浓度 0 .32mmol/L ,模板DNA为 1 5ng ,TaqDNA聚合酶为 2U。PCR反应程序为 :94℃ 3min ;94℃ 1min ,38℃ 1min ,72℃ 2min ,40Cycles ;72℃ 1 0min。

烟草RAPD反应体系的建立与优化研究

以烤烟品种为材料,研究了烟草RAPD分析过程中的影响因素,包括模板浓度、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、循环次数、退火温度等,建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系:即在25μl反应体系中,模板用量为40ng;引物浓度为0.4μM;Mg2+浓度为2.5mM;dNTP浓度为0.2mM;TaqDNA聚合酶用量为1U。扩增程序为94℃预变性5min;然后94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸1.5min,39个循环;最后72℃延伸5min。

多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用

目的：建立与应用多种探针的 RT-PCR分析 H5N1病原体的检测方法体系。方法通过 GenBank发表的基因序列分析，针对保守区分别设计并合成2对特异性引物（P1/P2，P3/P4）。通过对扩增条件的优化，建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法。结果合适引物浓度：P1/P2为0.32μmol/L，P3/P4为0.96μmol/L。双重检测的最小病毒核酸量为2 ng/μl，H5N1病原体混合液在相对应位置出现特异性条带，而其他病毒及空白对照均未出现条带。结论多种探针的RT-PCR分析对于 H5N1病原体检测方法在合理引物浓度的应用下具有很好的敏感度与特异度，值得在检验中推广应用。

土鳖虫ISSR-PCR反应体系的建立及优化

药用土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖（Eupolyphaga sinensis Walker）或冀地鳖（Steleophaga plancyi（Boleny））的雌虫干燥体[1],临床上广泛应用于高脂血症、血栓性疾病和心脑血管缺血等疾病的治疗。目前,缺乏对不同种质的土鳖虫进行系统评价的方法,因此在分子水平上开展对土鳖虫的种质资源研究对于土鳖虫种质资源的合理开发和利用具有重大意义。

ARMS实时PCR基因分型特异性的研究

以原癌基因Kras基因12位密码子的4种基因型(野生型为GGT,突变型为AGT、TGT、CGT)质粒DNA为研究模型,采用SYBRGreenⅠ为实时PCR指示剂,进行ARMS实时PCR基因分型特异性的研究.结果表明:在和模板匹配的ARMS引物3′端附近引入故意错配碱基,将ARMS引物浓度稀释10倍,并对传统三步PCR循环进行改良,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异,在传统延伸步骤之后增加一步恒温80℃检测荧光步骤,可消除引物二聚体的影响,使ARMS引物的特异性增强,得到清晰的基因分型结果.实验表明这种基于SYBRGreenⅠ的ARMS实时PCR基因分型方法,无需合成探针,实验设计简单,是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法,可推广用于其他基因的分型,并可望成为应用于临床的基因诊断技术之一.

梨树RAPD分析条件的优化

以黄花梨为试材,建立了梨树RAPD分析的优化反应条件,即25μL反应体系中含有Tris-HCl(pH9.0)10mmol/L,KCl50mmol/L,MgCl22.0mmol/L,dNTP200μmol/L,模板DNA10ng,引物400μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U.适宜的扩增程序为94℃120s,1个循环;94℃60s、37℃75s、72℃120s,45个循环;72℃10min,1个循环.

利用正交设计优化辣椒的SRAP反应体系

以辣椒雄性不育保持系B-07LP为试材,利用正交设计L16(45)在5个水平上对影响辣椒SRAP反应体系稳定性的dNTP浓度、引物用量及Taq酶活性浓度梯度等外部条件进行了优化试验。在此基础上,通过单因素完全随机试验确定了辣椒SRAP关键反应因子的适宜浓度。其中引物浓度为0.4μmol/L、dNTP的适宜浓度为0.2 mmol/L及适宜的Taq酶活性浓度为0.3 U/μL,并对所建体系的稳定性进行了验证。

微卫星PCR扩增反应技术条件优化探讨

微卫星PCR扩增反应受诸多因素的影响,不同的Mg2+浓度、退火温度、引物浓度、dNTP浓度、模板量、不同厂家的TaqDNA聚合酶、不同的PCR仪等都会对扩增反应结果有不同程度的影响。在进行PCR反应前,须对这些条件反复摸索优化,以获得最佳反应体系。

影响芥蓝×甘蓝RAPD标记稳定性的外部条件优化研究

通过对影响RAPD标记稳定性的引物浓度梯度、退火温度梯度、dNTP浓度梯度、Taq酶浓度梯度等外部条件的优化研究,确定了RAPD反应适宜的引物浓度为0.1～0.2 pmol/μL,退火温度为48～52 ℃,dNTP浓度为0.3～0.15 mmol/L及Taq酶浓度为0.3 U/μL,提高了该反应体系中RAPD的稳定性.

一种检测肿瘤癌基因扩增的新技术一差别PCR技术

一种检测肿瘤癌基因扩增的新技术一差别ＰＣＲ技术方刚，于泽平，刘复坤（南京军区总医院肿瘤室，南京２１０００２）差别ＰＣＲ技术，快速、敏感无同位素污染，该技术的检测原理是在一定的ＰＣＲ反应条件下，ＰＣＲ产物的量与ＰＣＲ模板的拷贝数是正相关，反映了模板拷贝...

DuCV和GPV与DEV三重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中的序列,合成针对鸭圆环病毒(DuCV)REP基因、鹅细小病毒(GPV)NS1基因、鸭肠炎病毒(DEV)UL6基因的3对特异性引物,以病毒的克隆质粒作为模板,进行退火温度、引物终浓度的优化,建立一种能同时鉴别DuCV、GPV、DEV的三重PCR检测方法,并检验该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示:试验所建立的三重PCR检测方法的最适退火温度为58.5℃,引物DuCV REP、GPV NS1、DEV UL6的最适终浓度分别为0.9、0.6、0.7μmol/L;该方法能够同时扩增出DuCV、GPV和DEV的特异性片段,而不能扩增出NDV、RA、AIV、DHV和TUMV,表明该方法特异性强;该方法对质粒DuCV、GPV和DEV模板的最低检测量分别为1、100、10 fg,表明该方法敏感性好;运用该方法对DuCV+GPV+DEV、DuCV+GPV、GPV+DEV、DuCV+DEV、DuCV、GPV、DEV进行检测,均能扩增出与预期一致的特异性片段,表明该方法重复性好;运用该方法对42份临床样本进行检测,其检出率分别为26.19%、30.95%和19.05%,与单一PCR的检出结果一致,表明该方法能适用于临床样本的检测。试验建立的方法具有快速、简便、特异性强、敏感性好、重复性好等特点,可用于DuCV、GPV和DEV临床样本混合感染的快速诊断及鉴别诊断。

荧光定量PCR检测食品中沙门氏菌研究

实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)实现了PCR从定性到定量的飞跃,可对目标DNA分子起始拷贝数精确定量。因其检测方法精确、灵敏、污染途径少,已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法,在食品中安全微生物的鉴定也有重要应用[1]。沙门氏菌是引起食物中毒最为常见的致病菌,因此,建立食品中沙门氏菌中荧光定量PCR检测方法有重要的研究意义。材料与方法 1菌株:鼠伤寒沙门氏菌(C77-31)有中科院微生物所提供,肉类。

芒果ISSR反应体系的建立与优化

运用L16（4^5）正交设计对芒果ISSR反应的5个因素，即DNA模板浓度、M矿浓度、dNTPs浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化试验，通过不同反应体系扩增效果比较，建立优化的芒果ISSR反应体系，

基于金纳米粒子的聚合酶链反应

系统研究了基于金纳米粒子的聚合酶链反应(PCR).通过Au-S键将5′端修饰-SH-(CH2)6-的引物连接在金纳米粒子表面,采用质粒pBluescriptSK作为模板,分别研究了引物浓度、退火温度和循环次数对PCR的影响.实验研究结果表明:在优化的条件下,将上游引物或下游引物连接在金纳米粒子表面以及将上游引物和下游引物分别连接在金纳米粒子表面,均能顺利进行PCR.基于金纳米粒子的PCR技术的建立,将均相体系中的PCR技术扩展到纳米粒子表面,不仅可以方便目标PCR产物的分离纯化,而且可以为制备连接在纳米粒子表面的ssDNA和纳米结构材料提供新的方法.

4种番茄病毒多重RT-PCR检测及应用

番茄是全世界栽培最为普遍的果菜之一,2011年世界番茄栽培面积约805万亩,年产量约3 773万t,我国是世界番茄种植大国之一,2011年面积96667公顷,产量约679万t,随着番茄种植面积不断扩大,番茄病毒病的危害逐年加重。世界范围内番茄除了已有的TMV抗病资源与育成的抗病品种外,缺少CMV等抗病种质与抗病品种。