利用Mini-Tn5转座子诱导弗氏枸橼酸杆菌插入突变的研究

目的 研究以自杀性质粒pUT携带的Mini Tn5转座子对弗氏枸橼酸杆菌进行转座诱变。方法 转座采用双亲本接合法 ,对获得的接合子进行无抗性选择条件下的连续传代测定其稳定性 ,并测其氨苄青霉素耐性及进行质粒提取以排除质粒传代原因造成假阳性的可能。对接合子进行营养缺陷株和运动突变株的筛选。结果 Mini Tn5Km转座率约为每受体菌 9 2× 10 - 6 ,接合子在无抗性选择的情况下培养 3代仍保持稳定 ,卡那霉素抗性不消失 ,说明插入到染色体上的转座序列是稳定传代的。接合子的抗性是染色体而非质粒编码的结果。对营养缺陷株的筛选和分析提示 ,转座子的插入是随机的 ,弗氏枸橼酸杆菌染色体中无明显的转座插入热区。使用该转座子能有效筛出运动突变株。结论 Mini Tn5系列转座子适于大规模筛选弗氏枸橼酸杆菌突变株。

弗氏枸橼酸杆菌CF74的FliS蛋白功能研究

目的研究弗氏枸橼酸杆菌CF74的FliS蛋白功能。方法构建弗氏枸橼酸杆菌CF74 fliS的精确缺失突变株(CF74ΔfliS)及其互补菌株(CF74pfliS),并进行细菌游动性实验,检测它们对THP1细胞的粘附性和细胞毒性的作用。并用Western blotting方法检测FliC蛋白在培养上清中的分泌。结果弗氏枸橼酸杆菌CF74ΔfliS突变株没有游动性,而回补株CF74pfliS回补了游动性。而且,CF74ΔfliS突变株降低对THP1细胞的粘附和细胞毒作用,其回补株恢复了粘附性和细胞毒性。此外,CF74ΔfliS突变株降低FliC蛋白在培养上清中的分泌。结论 FliS蛋白影响弗氏枸橼酸杆菌CF74的游动性,并参与其对宿主细胞的粘附和细胞毒作用。

弗氏枸橼酸杆菌脂多糖突变株发生鞭毛合成异常

目的探讨弗氏枸橼酸杆菌群集运动的分子机制。方法用M in i-Tn5 Km转座子诱导获得弗氏枸橼酸杆菌群集运动突变株;通过反向PCR扩增突变基因并测序,从而确定发生突变的基因;观察突变株的运动和形态等特征。结果研究表明有7株突变株涉及3个与脂多糖合成有关的基因突变,分别为wzxB、waaW、waaL,导致弗氏枸橼酸杆菌群集运动能力显著下降。同时,这些突变株的鞭毛合成也出现异常,即培养的细菌中仅有小部分呈现正常的鞭毛合成,而大多数菌体聚集在一起,且鞭毛合成呈抑制状态,电镜观察发现多数聚集的菌体没有鞭毛或只有很少的鞭毛。与之相对应的是,野生株没有这个现象。结论脂多糖结构的缺失影响弗氏枸橼酸杆菌鞭毛的生成,进而影响其群集运动能力。

弗氏枸橼酸杆菌yeeZ基因突变引起细菌分裂抑制

目的通过确认引起弗氏枸橼酸杆菌分裂抑制的致突变基因yeeZ,了解其与细菌分裂的关系。方法对弗氏枸橼酸杆菌进行广泛的转座突变,筛选菌体变长的突变株,用反向PCR方法对突变株的失活基因进行定位测序;构建自杀载体EK-I质粒并利用单交叉重组机制重新构建yeeZ突变株,观察其生物学特征并与转座突变株比较。结果经基因测序定位确认发生分裂抑制突变的是yeeZ基因,重新构建的yeeZ基因自杀突变株的生物学特征与转座突变株完全一致。结论弗氏枸橼酸杆菌yeeZ基因失活可引起细菌的分裂抑制,即yeeZ基因的功能与细菌分裂有关。

检出与志贺菌属具有共同抗原的弗氏枸橼酸杆菌

构橼酸杆菌属是人和动物肠道的正常菌群,属条件致病菌,常导致院内感染[1],近年来已逐渐引起医学界的重视。该菌属与肠杆菌科其它菌属之间的抗原关系密切,其抗原性与沙门菌同和埃希菌属的部分菌种之间有交叉反应[2-3],但国内未见报道本菌属与志贺菌属之间具有属外抗原关系。我们于2001年7月从盲流人员不明原因腹泻患者肛拭标本中分离出一株与志贺菌属有共同抗原的弗氏构橼酸杆茵。现报告如下:1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本来源 取自该群病人中一名未服抗菌药的急性腹泻（脓血便）患者（女,8岁）。1.1.2 培养基 GN增菌液、SS琼脂、麦康凯琼脂。

腹泻病人粪便中弗氏枸橼酸杆菌的分离鉴定

腹泻病人粪便中弗氏枸橼酸杆菌的分离鉴定李士永，刘均凤，孙天梅，杨其元，崔树玉枣庄市卫生防疫站２７７１０１（山东枣庄）枸橼酸杆菌属的细菌多见于食物、粪和尿中，但它能否致病尚待研究［１］。１９９２～１９９３年我们从３００例腹泻病人粪便中检出１０株弗氏枸橼...

弗氏枸橼酸杆菌中发现介导bla_(KPC-2)传播的新型质粒及比较基因组学分析

目的探讨来自弗氏枸橼酸杆菌的产碳青霉烯酶的新型不相容群组质粒pNY2385-KPC的耐药机制及基因结构特征。方法从宁波市医疗中心李惠利医院急诊病房的发热患者尿液样本中获得1株多药耐药菌。采用16S rRNA基因扩增和平均核苷酸一致性(ANI)进行菌种鉴定;采用全自动细菌鉴定及药敏分析系统检测细菌MIC值;通过“三代”测序方法获得基因组序列,然后通过BLASTP/BLASTN、RefSeq、ConservedDomains、ResFinder、Isfinder等对基因功能进行详细注释及比较基因组学分析。结果弗氏枸橼酸杆菌NY2385携带的质粒pNY2385-KPC为一种新型不相容群组质粒,包含bla_(KPC-2),具有接合转移(Ⅳ型分泌系统)基因,可发生接合转移。NCBI中共检索到同型质粒15个,来源于弗氏枸橼酸杆菌、黏质沙雷菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和植生拉乌尔菌等细菌,为泛宿主质粒。通过对来自弗氏枸橼酸杆菌中6个该新型质粒进行序列比较分析,发现该新型质粒结构具有一定的保守性,具有携带bla_(KPC-2)的Tn6296变体结构,而且质粒pCF1807-3同时具有repApNY2385-KPC和repAIncX8。结论弗氏枸橼酸杆菌中的pNY2385-KPC型质粒均携带bla_(KPC-2)耐药基因,分为repApNY2385-KPC单复制子和repApNY2385-KPC/repAIncX8双复制子两种亚型,属于泛宿主质粒,作为可移动遗传元件促进了bla_(KPC-2)的传播。

弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS影响FliC的表达和分泌

目的研究弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛功能。方法构建弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛的精确缺失突变株(CF74ΔT6SS)。对弗氏枸橼酸杆菌CF74和其突变株CF74ΔT6SS的全菌蛋白和上清蛋白进行提取,并进行2-DE分析。结果在CF74ΔT6SS全菌蛋白中,有4个蛋白表达上调,42个蛋白表达下调,并且Fli C的表达下调十分明显;在CF74ΔT6SS的培养上清中,有27个蛋白表达上调,36个蛋白表达下调,并且Fli C、Flg K和Fli D的表达下调十分明显。结论弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS可以影响Fli C蛋白的表达和分泌。

弗氏枸橼酸杆菌TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立针对弗氏枸橼酸杆菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real time-PCR)检测方法。方法针对弗氏枸橼酸杆菌的特有序列设计引物和TaqMan探针,扩增目的基因建立标准曲线,确定检测方法的灵敏度;对20种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌进行检测,评价该检测方法的特异性;使用牛奶模拟标本评价方法在实际检测工作中应用性。结果 TaqMan real time-PCR检测方法对弗氏枸橼酸杆菌重组质粒的检测灵敏度为1.0×101拷贝/反应体系;该检测方法在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增。该检测方法对牛奶模拟样本中弗氏枸橼酸杆菌检测下限为1.0×102cfu/ml的菌量;通过对1.0×107、1.0×105和1.0×103三个浓度质粒标准品的重复检测,确定本方法的组内变异系数为1.90%～3.91%;组间变异系数为1.52%～1.69%。结论本研究建立的TaqMan real time-PCR检测方法可作为检测弗氏枸橼酸杆菌灵敏、特异、快速的方法。

潜在致病性的弗氏枸橼酸杆菌的筛查

目的筛查具有潜在致病性的弗氏枸橼酸杆菌。方法对从河南省睢县分离到的36株弗氏枸橼酸杆菌进行黏附HEp-2细胞的检测,以及与HEp-2细胞(MOI:100)作用10 h后的乳酸脱氢酶(LDH)释放情况分析。同时比较弗氏枸橼酸杆菌CF74(Citrobacter freundii 74)、CF72(Citrobacter freundii 72)、肠聚集性大肠埃希菌(Enteroaggregative E.coli,EAEC)、肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)2348/69和HB101的黏附和细胞毒性差异。结果 16株弗氏枸橼酸杆菌几乎没有黏附性,黏附指数<1;18株弗氏枸橼酸杆菌具有中等强度的黏附性,黏附指数<100;2株弗氏枸橼酸杆菌CF74和CF65(Citrobacter freundii 65)具有强的黏附性。与HEp-2细胞作用10 h后,除了CF74(24.4%),其余的35株弗氏枸橼酸杆菌具有低的LDH释放量,LDH释放量与阴性对照HB101(5.02%)相似。说明除了CF74,其余的弗氏枸橼酸杆菌不具有细胞毒性。CF74具有和EAEC042一样的聚集性黏附类型,并且CF74引起的LDH释放率明显高于CF72、2348/69和HB101(P<0.01)而低于EAEC17-2。结论作为潜在的致病菌,CF74具有强的黏附性和细胞毒性。

一种鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌的PCR方法

目的利用基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法,鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌和O157大肠埃希菌。方法用微生物鉴定仪对细菌进行生化鉴定,与O157血清凝集,同时扩增wzx基因。结果25株与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌及1株不与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阳性,8株与O157血清不凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阴性,20株O157∶H7大肠埃希菌wzx基因扩增为阴性。结论对于可与O157血清发生强凝集的弗氏枸橼酸杆菌,基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法是一种有效的快速鉴别方法。

四重荧光定量PCR技术用于食品中4种肠道致病菌的检测

用已建立的四重荧光PCR方法、传统国标或行标方法、MALDI Biotyper高通量微生物鉴定法(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法)对随机抽取的14份食品样品进行检测,比较3种检测方法的匹配性。并用四重荧光PCR对农贸市场、大型超市采集的10类食品共205份样品进行检测。旨在研究四重荧光PCR法在食品中检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的应用及食品中这4种菌的污染情况。在205份食品样品中,受污染的食品有110份,污染率53.66%(110/205),同时检出两种及两种以上致病菌的样品有62份,占污染样品的56.36%(62/110)。迟缓爱德华菌大肠菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌的检出率分别为7.80%(16/205)、53.66%(110/205)、26.34%(54/205)、5.85%(12/205)。在这3种检测方法中,四重荧光PCR的特异性好、准确性高,操作简便省时,更适用于食品中4种致病菌的快速检测。抽检的食品样品中存在这4种菌的污染,尤以生禽畜肉和水产品污染严重,需加强对食品加工、流通环节的卫生监管和监测。

转座突变株插入位点侧翼序列的研究

目的比较用于扩增弗氏枸橼酸杆菌转座突变株插入位点侧翼序列的3种PCR方法,以选择最有效、最简便的扩增方法进行转座突变基因的分析。方法分别采用step-outPCR、随机引物巢式PCR和反向PCR对弗氏枸橼酸杆菌转座突变株基因组中插入位点的侧翼序列进行扩增,并取产物进行直接测序,以对方法的有效性进行比较。结果随机引物巢式PCR方法简便,但扩增产物的条带较多,不利于后续的测序操作。Step-outPCR产物中非特异性片段更多,方法不可取,反向PCR法最为简便有效。结论反向PCR法适宜用于扩增弗氏枸橼酸杆菌转座突变株插入位点的侧翼序列,可以对突变基因进行定位。

坏死性筋膜炎

坏死性筋膜炎(Necrotizing Fasciitis)是以筋膜和皮下组织广泛坏死为主的严重化脓性感染。多发生在四肢、腹壁和手术创口等部位,病情凶险,死亡率高。若能早期确诊,尽早清创引流,则能使预后改善。本院自1973年9月至1987年9月共诊治4例,报道如下。临床资料本组男性3例,女性1例。年龄33～38岁。病灶位于右大腿前内侧1例,左下肢后外及左下腹壁1例,右下腹及骼窝区1例,肛周会阴部1例。有不同诱因3例,无诱因者1例。致病菌为多种细菌混合感染,如肠链球菌,弗氏枸橼酸杆菌,大肠杆菌,产气肠细菌,绿脓杆菌。全组病例均有筋膜和软组织的广泛坏死,病灶周围明显水肿。

多重PCR技术同时检测四种肠道致病菌方法的建立与初步应用

目的建立同时检测4种食源性肠道致病菌的多重PCR方法。方法分别依据沙门氏菌(Salmonella spp)的fimA基因、弗氏枸橼酸杆菌(Citrobacter freundii)的ldh基因、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的idsC基因、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)的fimA基因设计4对特异性引物,并对多重PCR反应条件进行优化。结果建立的多重PCR方法具有结果可靠、灵敏度高、方便快捷的优点。结论本研究为研发快速检测以上4种食源性肠道致病菌的试剂盒提供了重要技术保障。

4种肠道致病菌的多重荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据沙门菌的invA基因、弗氏枸橼酸杆菌的ldh基因、奇异变形杆菌的ureR基因和迟缓爱德华菌的fimA基因的保守序列,分别设计合成4对特异性引物和4个Taqman探针,通过对PCR反应体系的优化,并对该方法的特异性、敏感性进行评估,建立了一种能同时检测沙门菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌、迟缓爱德华菌的四重荧光定量PCR快速检测方法。该方法可特异性的检测到4种目标菌株的单一模版及混合模板,未发现不同成分间的交叉反应,最低检出限均为103cfu/mL;对22种非目标病原菌进行检测均为阴性。本研究建立的四重荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强,可用于上述4种致病菌的同时快速检测。