弗氏柠檬酸杆菌RPA-LFD快速检测方法的建立及应用

为建立一种针对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)敏感性高、特异性强的临床快速检测方法,根据该菌定居因子基因cfa的保守序列,设计特异性引物,采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),并结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)方法进行反应条件的优化及特异性与灵敏度的检测。结果表明:本研究中所建立的弗氏柠檬酸杆菌重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条(RPA-LFD)快速检测方法,在38℃条件下扩增20 min后,能特异性地检测到弗氏柠檬酸杆菌,对弗氏柠檬酸杆菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限分别为1.5×102 CFU/mL和200 fg/μL,是常规PCR(cfa引物)检测灵敏度(20 pg/μL)的100倍;利用所建立的RPA-LFD法与常规PCR同时检测杂交鲟攻毒试验样本,两种方法的检测结果一致。研究表明,本研究中建立的弗氏柠檬酸杆菌RPA-LFD方法,操作简便、反应迅速、特异性好、灵敏度高,并且不需要昂贵的仪器,该方法可为未来弗氏柠檬酸杆菌细菌性疾病的早期诊断提供更有效的技术支持。

弗氏柠檬酸杆菌的鉴定及其药敏试验

为进一步明确分离自仔猪腹泻肛拭子样本的弗氏柠檬酸杆菌病原特性、耐药情况及其对小鼠的致病性,试验通过5%兔鲜血TSA培养基培养、生化指标测定、敏感药物和耐药基因筛选对其进行鉴定,并用其腹腔注射攻毒小白鼠,分析其对小鼠的致病性。结果显示,分离到的弗氏柠檬酸杆菌在血平板上生长时导致溶血现象。生化试验中,硝酸盐还原、山梨醇和葡萄糖发酵等9个检测指标为阳性;且该菌对氧氟沙星、诺氧沙星、万古霉素、青霉素和链霉素耐药,并携带aacA-aphD、ileS和vanA3种耐药基因。该菌对小鼠的致死率为60%,剖检发现小鼠肝脏、肺脏、肠道、肾脏和脾脏组织发生不同程度病理变化,其中,小鼠肝脏和肺脏组织的出血症状最为明显;组织病理学观察发现,肝脏组织可见多量中央静脉淤血,肝窦内可见淤血;肺脏组织可见大量血管淤血,大面积肺泡壁间质淤血;肠绒毛黏膜上皮与固有层轻度分离。试验结果可为弗氏柠檬酸杆菌致病机理的进一步研究提供参考,也可为仔猪潜在细菌性疫病防治提供了数据支撑。

广西地区美国牛蛙源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定、耐药性及组织病理

为了探明2022年5月在广西南宁某养殖基地引起美国牛蛙暴发疾病的原因,本实验从患病美国牛蛙的肝脏、脾脏、肾脏和肠道中分离出优势菌,采用形态学观察、生理生化实验、16S rRNA基因序列测定及系统发育学分析进行鉴定。为确定该菌株的致病机理,对该菌株进行了人工感染实验、组织病理学观察、毒力基因检测、药物敏感性实验以及耐药基因检测。结果显示,在患病濒死美国牛蛙的肝脏、脾脏、肾脏以及肠道均分离到单一的优势菌株,从肠道分离得到的一株优势菌被命名为NFCF-02,并经鉴定为弗氏柠檬酸杆菌。该菌株携带viaB、ompX、ureE、ureD、ureG和ureF等6种毒力基因,对美国牛蛙的半数致死浓度为3.12×10^(6)CFU/mL,发病临床症状包括肝脏变黄、花肝、肝脏坏死;肾脏充血发红、胃表面有血丝以及肠道呈红色和充血。组织病理学观察发现,其肝细胞变性坏死,肝索排列紊乱;肾小管上皮细胞肿胀坏死、严重区域肾小管崩解、坏死;脾脏中央静脉扩张淤血,含铁血黄素、色素细胞增多;肠黏膜脱落,肠上皮细胞坏死脱落,杯状细胞坏死。药敏实验结果显示,分离菌株NFCF-02对新霉素、多黏菌素B、头孢拉定、多西环素等4种抗菌药物敏感,对林可霉素等14种抗菌药物已产生耐药性,携带gyrA、Sul1等7种耐药基因。研究表明,弗氏柠檬酸杆菌对美国牛蛙具有高致病性,可引起美国牛蛙肝脏和肠道等多器官组织的病理损伤,最终引发机体的损伤甚至死亡。本研究首次从组织病理学分析和毒力因子携带情况的角度确定了弗氏柠檬酸杆菌对美国牛蛙的致病力,为养殖美国牛蛙中弗氏柠檬酸杆菌病的诊断和药物防控提供了参考依据。

40种中草药及其复方对弗氏柠檬酸杆菌的体外抑菌作用

为有效防治因弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)引发的水产疾病,测定了40种单方中草药及其复方中草药对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)源弗氏柠檬酸杆菌的体外抑菌作用。运用平板打孔法测定40种单方中草药的抑菌圈大小,然后测定4种抑菌效果较好的中草药对弗氏柠檬酸杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,并对这4种中草药进行复方作用评价。实验结果表明,12种中草药具有抑菌作用,其中乌梅的(Fructus mume)抑菌圈直径为23.33±0.33 mm,最小抑菌浓度为31.25 mg/mL,抑菌等级为极度敏感。五倍子的抑菌圈直径为18.00±4.00 mm,最小抑菌浓度为62.5 mg/mL,为高度敏感。复方中草药中乌梅+五倍子组的抑菌效果最好,抑菌圈直径大小为16.50±0.41 mm,最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为31.25 mg/mL和62.5 mg/mL。这一研究表明,单方中草药乌梅和复方中草药乌梅+五倍子对弗氏柠檬酸杆菌具有良好的抑制作用,可以用于水产养殖中克氏原螯虾弗氏柠檬酸杆菌病的防治。

丹顶鹤源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药敏结果分析

为查明一例源于安徽省某动物园的丹顶鹤死因,从该丹顶鹤肝部组织坏死灶采集病料,进行细菌分离与鉴定,并对其药敏结果进行分析。结果表明:该菌落在血琼脂平板上生长呈白色不透明菌落,革兰氏阴性菌;生理生化试验显示,该菌在葡萄糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、硫化氢中均呈阳性;PCR扩增其16S rDNA基因,其大小约1500 bp,经系统进化树分析,与已报道的弗氏柠檬酸杆菌NBRC 12681菌株(NR 114345.1)在同一分支;药敏结果显示,其对氧氟沙星和庆大霉素高度敏感,对丁胺卡那、多粘霉素B中敏;对青霉素、阿莫西林、恩诺沙星、头孢噻肟、氨苄西林、复方新诺明、氟苯尼考耐药。综上所述,本次从患病丹顶鹤肝部分离的病原是弗氏柠檬酸杆菌,其对多种抗菌药具有一定的耐药性。

一起番鸭感染弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药敏结果

为确定乌鲁木齐市米东区某番鸭养殖场因饲喂冷冻海鱼有番鸭死亡的情况,无菌取死亡番鸭实质脏器、胃内容物,冷冻海鱼脏器开展细菌培养,从死亡番鸭胃内容物及喂食鱼中分离到一株细菌。经形态学特征分析和细菌鉴定仪测定,分离的菌株为弗氏柠檬酸杆菌。药敏试验结果表明,分离菌株对头孢类抗生素环丙沙星和恩诺沙星高度敏感,对氧氟沙星中度敏感,对本次试验检测的其他24种抗菌药具有耐药性。

克氏原螯虾弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与药敏试验

为确定引起养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii)患病的病原种类及耐药情况,从患病克氏原螯虾肝胰腺取样进行常规细菌学检查,对分离株进行回归感染试验、形态观察、生理生化特性检测、16S rRNA和gyrB基因分析及药敏试验。结果显示:从患病克氏原螯虾肝胰腺分离到大量菌落形态和色泽一致的细菌,代表菌株X120523为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),具有较强致病性,对20种抗生素中的喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素敏感。

中华鳖弗氏柠檬酸杆菌败血症病原分离鉴定与药敏试验

利用常规分离方法对病鳖肝、肾、肠组织进行细菌性病原分离,并对所获得的纯培养物进行VITEK-32鉴定、药敏及人工感染试验。试验结果表明,弗氏柠檬酸杆菌是该败血症的一种主要病原菌,它对左旋氧氟沙星、庆大霉素等多种药物敏感。

红螯螯虾弗氏柠檬酸杆菌病病原的分离与鉴定

从濒死的红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)的肝胰脏中分离得到可疑病菌L1和L2,经细菌学鉴定2株细菌均为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii);经人工感染试验证实L1和L2均导致健康虾发病死亡,其LD50分别为2 2×105CFU/ind、7×105CFU/ind;2株细菌对14种药物的敏感性相似,对9种抗生素敏感,对5种抗生素有抗性。从中筛选出有效药物,应用于生产中取得了较好效果。

鲟源弗氏柠檬酸杆菌分离鉴定及药敏特性研究

鲟隶属于鲟形目（Acipenseriformes）,是中国近年来养殖发展较快的淡水养殖品种。虽然养殖技术及条件要求较高,但是由于养殖鲟鱼具有很高的经济价值,而且生长快、肉质好、全身是宝,因而受到广大养殖户推崇[1]。但是近年来随着养殖量的迅速增大,养殖集约化程度不断提高,造成鲟养殖环境不断恶化,使得鲟体质普遍下降,发病率大增。鲟鱼多发细菌性疾病,暴发性强。

克氏原螯虾病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其药敏与黏附特性

为了明确安徽省当涂县淡水养殖克氏原螯虾暴发性疾病的病原,取濒临死亡的病虾分离病原。从肝胰腺中分离到一株优势细菌（命名为XLX1分离株）,人工感染试验证实其具有较强的致病性;采用形态学检查、生理生化特性测定和细菌16S r RNA基因序列分析,确定XLX1分离株为弗氏柠檬酸杆菌。进一步对XLX1分离株进行药物敏感性、携带黏附素基因情况和细胞黏附性进行检测。结果显示：该分离株对头孢噻肟、庆大霉素、阿米卡星、硫酸新霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、替考拉宁和米诺环素敏感或中敏,对其他7种测试药物呈现耐药。该分离株携带黏附素基因cfa和ure基因簇;序列分析发现ure ABC结构基因和ure D关键辅助基因高度保守,在虾源分离株与人源参考株间前者的核苷酸和氨基酸序列同源性分别在93.2%～98.3%和91.7%～97.4%,后者的核苷酸和氨基酸序列同源性分别在90.8%～98.3%和94.7%～98.7%;与人源参考株相比,虾源分离株Ure ABC结构蛋白中第294、600和608位氨基酸,以及Ure D蛋白中的第62和122位氨基酸发生了有意突变。XLX1分离株可以聚集方式黏附于EPC细胞周围,平均黏附菌数为29.8±5.3,但随黏附时间延长,EPC细胞出现病变。上述研究结果可为防控弗氏柠檬酸杆菌引起的水产动物疾病提供理论依据。

中华绒螯蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的鉴定

目的对从一起自然发病的病(死)中华绒螯蟹(Eriocheir sinensisH.Milne-Edwards)肝胰腺中,所分离做纯培养的6株(HQ010516B-1至HQ010516B-6)菌,进行在主要生物学性状、感染试验的致病作用、对抗菌类药物的敏感性等方面的检验,旨在明确分离菌的种类、病原学意义及耐药特征等。方法在发病情况及主要病变检验的基础上,以6只病(死)蟹的肝胰腺为材料做细菌分离与纯培养,对纯培养菌做形态特征、理化特性、16S rRNA基因序列测定及系统发育学分析等方面较系统的鉴定,主要依据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.9th ed》(1994)并结合系统发育特征做菌种归类判定;以3×108CFU/ml的菌悬液,对健康蟹做感染试验,测定相应的致病作用;用琼脂扩散(K-B)法做对常用抗菌类药物的敏感性测定,以抑菌圈直径作为敏感与耐药的判定指标。结果分离做纯培养的6株菌为同种的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundi-i),对供试健康蟹有致病性,对供试37种抗菌类药物中的头孢噻肟等22种药物呈敏感或高度敏感、对四环素等5种呈低度敏感、对青霉素G等10种耐药。结论所检出的弗氏柠檬酸杆菌,构成了所检中华绒螯蟹病例的病原菌之一,对供试抗菌类药物未表现出敏感与耐药的明显株间差异性。

三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及定居因子抗原基因检测

2009年10月江苏赣榆地区某养殖场养殖的三疣梭子蟹出现大量死亡,症状主要表现为:病蟹行动缓慢、不摄食,蟹体消瘦,打开头胸甲可见肝胰腺、鳃、肌肉等内脏组织水肿,部分肝胰腺和肌肉组织呈腐烂状。从患病梭子蟹肌肉、肝胰脏、体内积液中分离到大量优势生长的细菌。人工感染试验,证明分离菌(JG091120-1)对健康三疣梭子蟹具有很强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等常规表型生物学检验,同时利用分子生物学方法测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,其中分离菌16S rRNA基因序列长度为1 451 bp(登录号HQ170626),gyrB基因序列长度为1 186 bp(登录号HQ170627),分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性。根据分离菌的表型及分子生物学特性,判定该菌为肠杆菌科枸橼酸属的弗氏柠檬酸杆菌。定居因子抗原cfa是肠杆菌科产肠毒素细菌的一种重要致病因子,利用特异性引物进行cfa基因的PCR扩增,分离菌可以扩增出大小在100 bp的基因片段,表明本次分离的病原弗氏柠檬酸杆菌具有cfa毒力因子。

弗氏柠檬酸杆菌感染诱导斑马鱼皮肤免疫相关基因的差异表达

从草鱼肠道中分离到1株细菌,通过形态学观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析等鉴定为弗氏柠檬酸杆菌,动物试验结果表明,该菌对斑马鱼有致病性;从感染诱导的斑马鱼皮肤组织中提取总RNA,经Biotin荧光标记与拥有15 617个cDNA片段的斑马鱼基因芯片(affymetrix)杂交筛选分析,获得斑马鱼皮肤免疫相关差异表达基因88个,其中有74个上调表达基因和14个下调表达基因;进一步根据基因功能聚类(GO)分析,初步将88个差异表达基因分为8个生物学功能,其中主要参与补体激活、急性期反应、应激防御反应、细胞凋亡、抗原加工提呈、细胞迁移粘附、凝血因子和血小板激活等免疫应答过程;同时进行信号通路(pathway)分析,结果表明MAPK(hsp70、daxx、nfkbiab)、JAK/STAT(ifn1)和TGF-β(thbs1)等信号通路参与斑马鱼皮肤抗弗氏柠檬酸杆菌感染免疫应答。采用基因芯片方法筛选与鱼类皮肤免疫相关的功能基因,为将来以斑马鱼为模型研究鱼类皮肤局部免疫应答的分子机制提供科学依据。

弗氏柠檬酸杆菌对动物和人致病性研究进展

弗氏柠檬酸杆菌在自然界广泛分布,是一种典型的人-畜-鱼共患病条件性致病菌,一般情况下不引起动物和人发病。近年来,陆续有报道弗氏柠檬酸杆菌强毒株也能引起动物败血症甚至急性死亡,且对水产动物的致病报道较多。人类可因弗氏柠檬酸杆菌感染而发生腹泻、食物中毒和继发感染。弗氏柠檬酸杆菌引起动物和人感染时有携带如β-内酰胺酶等新型耐药基因的可能,且发现有cfa、ST和SLT等多种毒力因子。综合研究表明弗氏柠檬酸杆菌可能是一种尚未被人们充分认识的病原菌,且有危害加重的趋势。因此,在动物和人类疾病防治中不能忽视弗氏柠檬酸杆菌。论文主要阐述了弗氏柠檬酸杆菌对动物和人的致病性方面取得的进展,旨在引起研究者对弗氏柠檬酸杆菌致病性的重视,并展望了弗氏柠檬酸杆菌未来研究的方向。

羊源致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定

旨在确定导致河南省某养殖场小尾寒羊细菌性感染死亡的病原。从3只不同时间发病死亡的小尾寒羊各组织脏器的病料中分离到3株细菌——LK-1、LK-2和LK-3株。经微生物自动鉴定仪鉴定和细菌16SrRNA基因序列分析,确定该致病菌为弗氏柠檬酸杆菌。小鼠毒力试验结果表明:3株细菌的LD50分别为5.0×107、6.0×107和5.8×107 CFU。回归试验结果表明,经人工感染健康小尾寒羊,可复制与自然发病羊相似的症状和病理变化,且从其各组织脏器内再次分离到相同的病原菌。药敏试验结果表明,3株弗氏柠檬酸杆菌对大部分药物的抗药谱相同(17/21),且均对头孢噻肟等11种药物高度敏感。这些研究结果表明弗氏柠檬酸杆菌是该小尾寒羊致死性病例的病原菌。本文在国内外首次报道了弗氏柠檬酸杆菌对小尾寒羊具有致病性。

花鳗鲡病原菌弗氏柠檬酸杆菌的鉴定

首次报道了从养殖花鳗鲡(Anguilla marmorata)肝脏中分离得到优势菌株AMRB6,经人工腹腔注射感染健康花鳗鲡试验,结果证实该菌有致病作用,其半数致死量LD50为3.2×107CFU/mL.结合菌体形态特征、常规生理生化鉴定和Biolog自动微生物鉴定系统鉴定,以及16S rRNA序列扩增结果,表明该菌为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii).30种药物药敏试验结果表明,该菌株对左氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素等14种药物高度敏感.

弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与PCR-SSCP分析

利用营养琼脂、MaC培养基从草鱼肠道中分离到3株细菌,暂时编号为TC-1、TC-2和TC-3,通过形态学观察、生理生化特征、药敏试验、动物试验、构建系统发育进化树及PCR-SSCP分析等系统鉴定,结果表明3株菌株均为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),其中TC-2菌株对小鼠、斑马鱼有致病性;3株杆菌均对头孢噻肟、头孢曲松、洛美沙星、诺氟沙星等多种药物敏感;系统发育分析表明,3株弗氏柠檬酸杆菌16S rDNA序列与DSM30039模式株同源性分别为99.59%、99.47%和99.53%,且位于系统发育树的同一分支;进一步采用V3区PCR-SSCP分析结果显示弗氏柠檬酸杆菌SSCP图谱中菌株间带型存在差异。

一株弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及致病性研究

为确定导致罗非鱼患病的原因,本试验对濒临死亡的罗非鱼进行无菌解剖,从心脏部位分离得到1株细菌,通过形态学观察、生理生化鉴定和16SrDNA分析,确定菌株为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。药敏试验结果显示,该菌株具有很强的多重耐药性,测试的20种药物中,该菌株对恩诺沙星、青霉素等13种药物具有完全耐药性,仅对头孢曲松、头孢他啶、头孢拉定、哌拉西林、舒巴坦5种药物敏感。人工感染试验结果显示,该菌对草鱼、黄颡鱼、罗非鱼、禾花鲤具有较强的致病性。本试验结果阐明了罗非鱼患病的原因,同时在养殖过程中可指导养殖户合理用药。

大鲵源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及胞外酶活性研究

为了确定重庆武隆大鲵养殖场患病大鲵的病原菌,并进行菌种鉴定及胞外酶活性研究,从具有典型症状的病鲵肝脏分离出一株菌株TNL12,根据形态学特征、生理生化特性及16SrDNA分析对菌株进行种类鉴定,通过人工感染试验确定病原菌株的致病性,利用平板法检测胞外酶活性.结果显示,所获菌株为革兰氏阴性短杆菌,无芽孢,其生理生化特性与弗氏柠檬酸杆菌一致.16SrDNA分析表明,TNL12与弗氏柠檬酸杆菌的同源性为99%,在系统发育树上与弗氏柠檬酸杆菌聚为一支.该病原菌可引起健康青蛙、大鲵出现感染症状,且感染症状与自然发病症状相似.胞外酶活性检测发现该菌可产卵磷脂酶、淀粉酶,但不产脂酶、蛋白酶、明胶酶、脲酶等胞外酶.这些研究结果表明,从患病大鲵中分离出的病原菌为弗氏柠檬酸杆菌,且对大鲵有较强的致病性.