弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到甘油脱水酶(glycerol dehydratase)基因dhaB、dhaC、dhaE,克隆到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-dhaBCE。将此重组质粒转化到E.coliJM109中,重组菌株SDS-PAGE结果显示有明显的61kD、22kD、16kD三条特异性蛋白条带出现。重组菌株经诱导表达,酶活力为11.59U/mL。

弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR)的基因dhaT,序列显示与来源于C．freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78％。将此基因构建于表达载体pSE380,得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E．coli JM109中进行了表达,重组酶通过镍柱及Sephacral S- 300进行纯化,重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8．0,对丙醛的Km值为10．05mmol／L,最大反应速度Vmax为37．27μmoL／min／mg;以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10．5,对1,3-PD的Km值为1．28mmob／L,最大反应速度Vmax为25．55μmol／min／mg。重组酶的还原反应比活为49．50U／mg,氧化反应比活为79．72U／mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。

弗氏柠檬酸菌1,3-丙二醇合成的代谢工程研究

【目的】研究弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)1,3-丙二醇合成的代谢过程。【方法】构建甘油脱氢酶基因GSR-lac Z、1,3-丙二醇氧化还原酶基因PDO-lac Z和甘油脱水酶基因GL-lac Z等报告基因。在此基础上,构建3个相应的转座子突变文库。【结果】筛选到6株突变子,其相应关键酶表达水平提高1-11倍,1,3-丙二醇产量提高幅度为3%-50%。对转座子插入位点分析显示,5株突变子插入位点均为β-内酰胺酶(CKO_02592)编码基因,1株突变子插入位点为二氢硫辛酰胺基转移酶(CKO_02433)编码基因。进一步分析发现,β-内酰胺酶基因突变显著提高甘油脱水酶和甘油脱氢酶的表达水平,而1,3-丙二醇氧化还原酶表达水平没有变化;二氢硫辛酰胺基转移酶基因突变显著提高1,3-丙二醇氧化还原酶表达水平,其他两种关键酶基因表达水平不变。【结论】β-内酰胺酶和二氢硫辛酰胺基转移酶基因能够分别影响1,3-丙二醇合成代谢途径关键酶的表达,为构建工程菌株打下基础。