白藜芦醇通过影响细胞外信号调节蛋白激酶信号通路对创伤性脑损伤后的神经保护作用

目的观察脑损伤后白藜芦醇对细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路在星形胶质细胞中活化表达的影响,探讨其神经保护的作用机制。方法建立创伤性脑损伤小鼠模型,随机分为DMSO组和白藜芦醇预处理组。采用FJC染色检测脑损伤后神经元凋亡情况,采用免疫荧光双重染色检测ERK信号通路在星形胶质细胞中的活化表达。结果 FJC染色结果显示,与DMSO组相比,白藜芦醇预处理组脑损伤后纹状体神经元凋亡的数量明显减少。白藜芦醇预处理组ERK信号通路在星形胶质细胞的活化表达降低。结论白藜芦醇对脑损伤后的神经保护作用与降低ERK信号通路在星形胶质细胞中的活化表达有关。

阻滞弥漫性脑损伤ERK1/2信号通路对星形胶质细胞反应的作用

目的研究阻滞弥漫性脑损伤急性期ERK1/2信号通路过度激活对星形胶质细胞反应的影响。方法制作大鼠外伤性弥漫性脑损伤模型,打击损伤前30min自尾静脉注射U0126。Western blot法检测损伤脑皮层pERK1/2表达水平,免疫组化染色法检测pERK1/2和GFAP在损伤脑组织中的表达。结果pERK1/2表达在损伤后迅速、显著升高,5min为表达高峰,其后下降,但直到损伤后72h都有高水平表达,至7d下降至基础水平。损伤后各个时间点,U0126组pERK1/2水平较DBI组明显降低(P<0.05)。U0126组与DBI组比较,12～72h各时间点GFAP阳性细胞平均光密度值降低(P<0.05)。结论弥漫性脑损伤诱导了强烈的ERK1/2信号通路激活和星形胶质细胞反应,U0126能够剂量依赖性抑制GFAP的表达,抑制急性期星形胶质细胞反应。

酸性成纤维细胞生长因子对大鼠缺血/再灌注损伤肠上皮细胞丝裂素活化蛋白激酶的影响

目的观察外源性酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对大鼠缺血/再灌注(I/R)损伤后肠上皮细胞丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性的影响,并探讨其与肠上皮细胞增殖能力变化的关系。方法采用大鼠肠系膜上动脉夹闭法制备缺血45min后再灌注动物模型。132只Wistar大鼠随机分为假手术组、I/R组、aFGF处理组(再灌注即刻颈静脉注射aFGF4μg)及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)阻断剂PD98059预处理组(缺血前尾静脉注射PD980597.5μg,再灌注即刻静脉注射aFGF4μg)。检测缺血前,I/R15、30min及1、2、6、12和24h时肠上皮细胞增殖能力和MAPK活性。结果aFGF处理后肠上皮细胞增殖明显增加,同时MAPK活性显著增高。用p44/p42MAPK(ERK1/2)阻断剂PD98059可抑制ERK1/2的活性,使肠上皮细胞增殖减少。结论aFGF可促进I/R损伤后肠上皮细胞增殖,并可能与其激活肠上皮MAPK有关。

磷酸化细胞外信号调节激酶1/2对糖尿病视网膜病变的作用

背景 糖尿病视网膜病变（DR）具有复杂的病理表现和发生机制,丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）参与高血糖对脑缺血损伤的作用,MAPK信号转导通路在DR发生和发展中的作用有待深入研究.目的 探讨DR与磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的关系.方法 采用随机数字表法将60只SPF级8周龄SD大鼠随机分为对照组和糖尿病组,将枸橼酸缓冲液配置的链脲佐菌素（STZ）溶液按照60 mg/kg的剂量一次性腹腔内注射制备糖尿病大鼠模型,血糖＞16.7 mmol/L视为建模成功;对照组以同样的方法注射枸橼酸缓冲液.分别于造模后4周和12周处死大鼠并分离视网膜,采用苏木精-伊红染色法进行视网膜的组织形态学观察,采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜磷酸化ERK1/2和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的相对表达量.结果 造模后4周和12周,糖尿病组大鼠血糖水平均明显高于对照组大鼠,差异均有统计学意义（t=14.174、13.771,P＜0.05）.造模后12周,糖尿病组大鼠平均体质量明显低于对照组;糖尿病组大鼠饮水量明显多于对照组,差异均有统计学意义（t=8.670、18.725,P＜0.05）.与对照组大鼠比较,造模后12周糖尿病组大鼠视网膜变薄,外丛状层水肿,视网膜神经节细胞（RGCs）层、内核层及视细胞层细胞数量减少.免疫组织化学检测可见,造模后4周和12周糖尿病组大鼠视网膜中GFAP阳性细胞数增加,相对表达量（A值）分别为3 197.1±13.1和7 202.0±56.8,均明显高于对照组的2 152.8±16.1和2 337.0±8.6,差异均有统计学意义（t=6.327、16.417,P＜0.05）.造模后12周,糖尿病组视网膜磷酸化ERK1/2相对表达量（A值）为2 850.6±2.4,明显高于对照组的1 274.6±1.3,差异有统计学意义（t=12.771,P＜0.05）.结论 ERKl/2信号通路参与STZ诱导的糖尿病大鼠的早期DR,可能与RGCs和视细胞的凋亡及Müller细胞活化有关.

神经调节素对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡和STAT3及GFAP表达的影响

目的探讨神经调节素-1β(NRG-1β)对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡、信号转导和转录激活因子3(STAT3)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法成年雄性Wistar大鼠,用线拴法经颈外-颈内动脉插线建立大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)动物模型,经颈内动脉单剂量注射1.5NRG-1β5μl干预治疗。荧光DendEndTUNEL法检测神经细胞凋亡;免疫组织化学和免疫荧光染色检测脑组织STAT3和GFAP表达。结果脑缺血再灌注损伤可诱导脑组织细胞凋亡和STAT3及GFAP表达。对照组随缺血时间延长,皮质、纹状体和海马区细胞凋亡逐渐增多,STAT3和GFAP表达逐渐增强。治疗组在缺血不同时间点细胞凋亡较对照组相应脑区显著减少(P<0.05),STAT3和GFAP表达水平较对照组相应脑区显著增强(P<0.05)。结论NRG-1β可能通过激活细胞JAK/STAT信号传导途径,促进星形细胞胶质化,启动神经细胞抗凋亡机制,对缺血性脑损伤起保护作用。

丙泊酚对神经元缺血再灌注损伤的保护与磷酸化蛋白激酶信号通路的关系

目的:探讨丙泊酚在脑缺血/再灌注损伤(CI/RI)中的作用及可能机制。方法:采用氧糖剥夺再灌注(OGD/RP)法体外构建缺血/再灌注细胞模型,将细胞分为对照组、OGD/RP组和丙泊酚+OGD/RP联合组。采用MTT法检测皮质神经元存活率,Annexin V-PI检测细胞凋亡情况,RT-PCR方法检测碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的m RNA表达,Western blot检测丙泊酚对皮质神经元内b FGF、磷酸化蛋白激酶B(p PKB)和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p ERK1/2)表达。采用小干扰RNA构建b FGF沉默的细胞。结果:丙泊酚能够显著促进CI/RI后神经元的存活,抑制其凋亡,OGD/RP处理组神经元凋亡率为43.2%,以10 mg/L的丙泊酚预处理后细胞的凋亡率即降为19.5%(P<0.05)。与对照组(1.02±0.03)相比较,OGD处理后细胞中b FGF的含量(0.78±0.06)显著下调(P<0.05),丙泊酚处理的皮质神经元中b FGF含量(1.43±0.04)显著高于OGD处理组(P<0.05)。沉默的b FGF或者施加蛋白激酶B(PI3K-p PKB)以及p ERK1/2信号通路抑制剂都会导致细胞存活率显著下降(P<0.05),抑制PI3K-p PKB以及ERK1/2的激活。结论:丙泊酚可以通过上调b FGF的表达,激活PI3K-p PKB和ERK1/2的信号通路,减轻体外培养神经元凋亡/再灌注损伤,从而增加皮质神经元的存活。

丙泊酚通过上调纤维细胞生长因子的表达激活磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B和磷酸化细胞外信号调节激酶1／2信号通路抑制体外培养神经元缺血／再灌注损伤

目的探讨丙泊酚在脑缺血，再灌注损伤（ischemia／reperfusioninjury，I／RI）中发挥的作用及其具体机制。方法采用氧糖剥夺再灌注（oxygen-glucose deprivation／reperfusion，OGD／RP）法体外构建缺血／再灌注细胞模型，将细胞分为对照组、OGD／RP组、丙泊酚＋OGD／RP组。采用甲基噻唑基四唑（methylthiazolyl tetrazolium，MTF）法检测皮质神经细胞存活率，AnnexinV-PI检测细胞凋亡情况，即时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的mRNA表达情况，免疫印迹法（Westernblot）检测丙泊酚对皮质神经细胞内bFGF，磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated proteinkinaseB，pAkt）以及磷酸化细胞外信号调节激酶1／2（phosphorylated extracellular signal-regulatedkinase1／2，pERKl／2）蛋白表达的影响；采用小干扰RNA构建bFGF沉默的细胞。结果OGD／RP处理组神经细胞凋亡率为43．2％，经10mg／L的丙泊酚预处理后，细胞的凋亡率降为19．5％。与对照组比较，OGD处理后，细胞中bFGF的含量显著下调（P〈0．05），丙泊酚处理的皮质神经元中bFGF含量显著高于OGD处理组（P〈0．05）。丙泊酚能够上调pAKT以及pERKI／2的表达，激活这两条信号通路。沉默bFGF或者施加磷酸肌醇3激酶．蛋白激酶B（phosphotylinosital3kinase-proteinkinaseB，P13K-Akt）以及pERK1／2信号通路抑制剂都会导致细胞存活率显著下降（P〈0．05），抑制P13K-Akt以及pERKl／2的激活。结论丙泊酚可以通过上调bFGF的表达，激活P13K-Akt和ERK1／2信号通路，增加皮质神经元的存活。

丙泊酚通过ERK信号通路时程依赖性激活大鼠海马星形胶质细胞

目的·检测丙泊酚对大鼠海马星形胶质细胞的影响,并探讨其作用机制。方法·根据丙泊酚注射时间,24只SD大鼠随机分为即时(0 min)组、45 min组和90 min组,每组8只。丙泊酚注射液(10 mg/m L)以100 mg/kg腹腔注射后,用定量PCR检测大鼠海马胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和S100β的m RNA水平。体外培养原代大鼠海马星形胶质细胞,并用10μmol/L细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)抑制剂PD98059预处理细胞2 h(不加抑制剂为对照),随后用10μmol/L丙泊酚孵育24 h,检测细胞活力及GFAP表达。结果·丙泊酚腹腔注射后45 min、90 min,海马组织中GFAP的m RNA水平分别是注射即刻(0 min)的(1.32±0.12)倍(P=0.000)和(1.12±0.09)倍(P=0.012),S100β的m RNA水平分别是注射即刻(0 min)的(1.14±0.11)倍(P=0.005)和(1.05±0.10)倍(P=0.284);而且,GFAP和S100β的m RNA水平均呈时程依赖性变化,先增高,而后降低。体外实验显示,丙泊酚显著提高原代海马星形胶质细胞的细胞活力(P=0.041)和GFAP的m RNA水平(P=0.026),但是丙泊酚的此作用可被ERK抑制剂PD98059逆转。结论·丙泊酚通过ERK信号通路时程依赖性地上调海马星形胶质细胞GFAP和S100β的表达,激活胶质细胞。

神经干细胞移植治疗大鼠恢复期脊髓损伤

背景:研究发现,脊髓损伤后细胞外信号调节激酶在反应性胶质细胞中存在上调现象,且磷酸化的细胞外信号调节激酶急剧增多。目的:验证神经干细胞移植对恢复期脊髓损伤大鼠的功能影响及其在病灶局部的分化及机制。方法:90只SD大鼠被随机分为3组,每组30只。对照组大鼠造模但不进行神经干细胞移植;静脉移植组及局部移植组造模后分别进行神经干细胞移植,分别于移植后的1,2,4,12,24周对各组随机抽取的6只动物后肢功能进行BBB评分及免疫组织化学染色。结果与结论:神经干细胞移植后,静脉移植组和局部移植组病灶局部可见Brdu阳性细胞;大鼠BBB评分逐渐提高,移植4周后静脉移植组和局部移植组BBB评分明显高于同期对照组;大鼠脊髓胶质纤维酸性蛋白、细胞外信号调节激酶1/2逐渐提高,4周达最大值,移植12周后胶质纤维酸性蛋白、细胞外信号调节激酶1/2较同期减少(P<0.05);微管相关蛋白2逐渐提高,4周达最大值,4周以后呈下降趋势,12周后不再有明显变化,但微管相关蛋白2较同期对照组增多(P<0.01)。结果提示,神经干细胞移植后可在病灶局部增殖分化为神经元和神经胶质细胞;两种移植方式的作用没有明显区别;神经胶质细胞再生的过程和细胞外信号调节激酶通路密切相关。

坐骨神经细胞外信号调节激酶的激活引起小鼠坐骨神经部分结扎后的神经病理性疼痛

背景丝裂原活化蛋白激酶家族在几种疼痛模型中都起着重要的作用，但是，磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylatedextracellularsignal-regulatedkinase，pERK）在周围神经损伤区域的具体作用尚不清楚。这项研究中，我们研究了受损的坐骨神经中pERK能否引起坐骨神经部分结31,术（partialsciaticnerveligation，PSL）的小鼠产生神经病理性疼痛。方法小鼠接受PSL，用蛋白印迹和免疫组化法检测坐骨神经中的pERKl／2（p44／42）。分两次注射U0126（一种ERK抑制剂），即PSL术前30分钟神经内注射（20nmol／2μl），PSL术后第1天神经周围注射（20nmol／10μl），分别用热刺激缩足实验和机械刺激缩足实验对PSL导致的热痛觉过敏和异常触痛进行评估。结果经蛋白质印迹法检测，从第1天至第14天，实施模拟手术的小鼠坐骨神经中pERK1／2水平恒定并且与未经实验的小鼠相同；而在行PSL手术的小鼠中，PSL术后第1天就发现pERK1／2明显增加，一直持续至术后第3天。经免疫组化法检测，行PSL手术组与行模拟手术组相比，术后第1天坐骨神经中pERK1／2的免疫活性显著升高。双重免疫染色法的结果证实，PSL术后第1天坐骨神经中pERK1／2的免疫活性增强区被Schwann细胞的标志物——神经胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）所确定，而巨噬细胞的标志物——F4／80却没有发现这种免疫活性的增强区。经U0126处理后，PSL术后第3天、第7天和第14天PSL诱发的热痛觉过敏明显减轻。经U0126处理后，在PSL术后第7天和第14天PSL诱发的异常触痛也明显减轻。结论受损周围神经系统的Schwann细胞中ERK激活可能对神经病理性疼痛的产生起了重要的作用。我们的研究结果说明pERK本身和ERK相关介质是神经病理性疼痛的潜在治疗靶点。