弱阳离子磁珠分离技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在原发性Ⅰ型骨质疏松症血清标志蛋白筛选中的应用

目的:探讨弱阳离子磁珠分离技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在原发性Ⅰ型骨质疏松症血清标志蛋白筛选中的应用价值,寻找对原发性Ⅰ型骨质疏松症进行筛查和早期诊断的新方法。方法:应用弱阳离子磁珠分离技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对16例绝经后骨质疏松症患者及9例绝经后健康妇女的血清蛋白进行筛选、分析,将经支持向量机模型预测的约登指数最高的差异蛋白峰作为候选标志物建立诊断模型,并对模型的判别效果进行验证。结果:2组血清蛋白标本共初选出123个递加质谱蛋白质峰。筛选出强度差异具有统计学意义的蛋白质峰16组,约登指数最高的4组差异蛋白质峰的质荷比分别为8 909.047、8 690.658、13 745.48、15 114.52。以这4个标志物作为候选标志物建立诊断模型,模型特异性、敏感性均为100%。2组标本在支持向量机结果散点图上可清晰区分。结论:采用弱阳离子磁珠分离技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术可筛选出原发性Ⅰ型骨质疏松症血清标志蛋白、建立诊断模型,为骨质疏松症的筛查和诊断提供了一种全新的血清学方法。

LTQ和SELDI-TOF质谱对弱阳离子磁珠捕获的血清多肽和蛋白的鉴定

[目的]鉴定弱阳离子磁珠捕获的血清多肽和蛋白峰。[方法]收集经弱阳离子磁珠从人血清中捕获后洗脱下来的蛋白,然后经过HPLC分离,各组分的一部分跑SDS-PAGE胶并用LTQ质谱鉴定,另一部分采用SELDI-TOF检测,最后结合参考文献信息初步确定部分峰的鉴定结果。[结果]通过SELDI-TOF检测结果发现5个组分有比较明显的峰,基于LTQ质谱鉴定了这5个组分分子量在30kD以下的蛋白,数据库搜索结果显示评分在100分以上共鉴定出66个单一蛋白。并初步确定了13个SELDI-TOF上峰的蛋白结果。[结论]HPLC分离富集结合SELDI-TOF和LTQ质谱能比较有效地鉴定丰度比较高的差异峰,是各种差异峰鉴定策略的有益补充。

磁珠分离结合质谱分析黏多糖病Ⅰ型患者尿液多肽谱

目的研究黏多糖病Ⅰ型(MPSⅠ)患者尿液小分子多肽谱,寻找对MPSⅠ型诊断的新方法。方法利用弱阳离子磁珠纯化(magnetic beads based weak cation exchange chromatography,MB-WCX)系统结合基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)的方法,检测8例于解放军总医院儿童医学中心确诊的MPSⅠ型患者(疾病组)和10例本院查体人员(健康对照组)的尿液标本,获得尿液小分子多肽谱,应用Clin Prot TM软件进行数据分析,找出差异多肽峰,并绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线),对比曲线下面积(AUC)、敏感度和特异性。结果质荷比1000-10000之间,两组尿液标本共筛选出7个具有统计学差异(P<0.05)多肽差异峰。其中在疾病组中表达上调的有4个峰,表达下调的3个峰。AUC面积大于0.9的多肽质荷比为:1069.6(0.982)和3217.3(0.946),两者的特异性均为87.4%,敏感性均达到100%。结论 MB-WCX联合MALDITOF-MS检测技术可获得MPSⅠ型患者和健康人的尿液差异多肽谱,为MPSⅠ型辅助诊断提供了一种无创的新方法。

原发性胆汁性肝硬化血清蛋白质谱的初步研究

目的筛选与原发性胆汁性肝硬化(PBC)相关的血清蛋白质分子标志物并建立指纹诊断模型。方法收集30例PBC患者血清,30例年龄、性别相匹配正常人,采用弱阳离子磁珠(MB-WCX)为检测介质,基质辅助激光解吸电离质谱(MADIL-TOF-MS)检测得到蛋白质谱,再应用基于磁珠的多维纳升级高效液相色谱及液体蛋白芯片指纹图谱(CLINPROT)系统比较两组血清蛋白质谱。结果在m/z100～10000范围内,检测出的129个蛋白峰中11个蛋白峰差异有统计学意义(P<0.05),其中m/z为4963.6、5805.33、1544.45、2292.16、2466.45、2845.85在PBC中表达上调,而m/z为3262.24、3191.2、4090.5、4072.43、3277.46的蛋白峰在PBC中下调;选择m/z为3262.24、3191.2这2个蛋白峰建立的蛋白芯片指纹图谱(CLINPROT)系统对PBC诊断的敏感性为90%,特异性为95%。结论筛选出的11个蛋白分子标志物可能与PBC有关,其中m/z4963在PBC中表达最明显;蛋白芯片指纹图谱(CLINPROT)系统可能对PBC的诊断具有一定临床意义。

基于蛋白质谱技术建立胃癌诊断预测模型及其初步验证

目的基于高通量蛋白质谱技术利用ClinProTools系统筛选胃癌患者与健康对照者的血清差异蛋白/多肽,建立胃癌诊断预测模型,发现胃癌的潜在血清标志物。方法收集胃癌患者血清标本60例、对照组血清标本60例,按照3∶1随机分为训练组(胃癌患者45例,健康对照45例)和验证组(患者15例,健康对照15例)。采用弱阳离子交换磁珠(WCX-MB)吸附低丰度蛋白/多肽,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析建立相应的蛋白表达指纹图谱,筛选差异表达蛋白/多肽,建立胃癌的诊断预测模型并进行验证。结果筛选出10个具有显著差异的多肽峰,差异最显著的2个多肽峰质荷比(m/z)2 952.57和m/z 5 904.36的受试者工作曲线(ROC)曲线下面积(AUC)分别为0.93和0.81。运用遗传算法(GA)建立胃癌诊断预测模型,验证组验证此模型,结果显示此模型准确性为90.00%,灵敏度为93.30%,特异度为86.70%。结论 MALDI-TOF MS联合WCX-MB能够检测到胃癌患者与健康对照者的血清差异蛋白/多肽,以此建立的胃癌蛋白质谱诊断预测模型存在着潜在的应用价值,m/z 2 952.57、5 904.36有望成为诊断胃癌的潜在血清标志物。

原发免疫性血小板减少症激素敏感与抵抗者血清蛋白质组学的研究

目的探讨原发免疫性血小板减少症(ITP)糖皮质激素治疗敏感与治疗抵抗患者血清蛋白质组学的差异。方法选择2016年3月~2017年3月我院住院ITP患者60例,其中激素敏感组32例,激素抵抗组28例。收集治疗前和随访4周后血清,利用弱阳离子磁珠联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)方法,寻找差异蛋白。结果两组患者治疗前血清蛋白指纹图谱相比较,在分子量700~10000 Da范围内共得到41个差异蛋白表达峰,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。敏感组患者激素治疗前后比较,在分子量700~10000 Da范围内有5个差异蛋白(P<0.05),激素治疗后表达上调的蛋白有4个,相对分子量分别为9289.84、4644.96、7764.95和4964.12 Da,下调的蛋白有1个,分子量为6666.94 Da。激素抵抗患者激素治疗前后比较,在分子量700~10000 Da范围内共得到56个差异蛋白质表达峰,差异无统计学意义(P>0.05)。结论激素敏感者治疗前后存在5个差异表达的蛋白,可能与ITP的激素治疗效果密切相关。

原发免疫性血小板减少症血清标志物的筛选

目的:利用弱阳离子磁珠联合MALDI-TOF-MS分析ITP患者和健康对照血清蛋白质表达谱,鉴定差异表达蛋白,建立ITP的诊断模型,探索ITP的发病机制。方法:选择ITP患者40例和健康对照40例,应用美国布鲁克.道尔顿(Bruker Daltonics)公司生产的WCX-MB(Weak cation exchange nanometer magnetic beads)捕获血清蛋白质组分,用Autoflex II基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS检测各样品的蛋白质质谱,再利用Bruker Daltonics公司的Cliprotools TM2.2软件进行数据分析,筛选差异蛋白质分子并建立ITP诊断模型,并选取20例ITP血清和20例健康对照血清对产生的模型进行分类验证和交叉验证。结果:40例ITP建模血清标本与40例健康对照建模血清标本经Clinprot系统检测蛋白质质谱,应用Cliprotools TM2.2软件进行数据分析,在分子量700-10000 Da范围内,可检测到55个差异蛋白质表达峰,其中有统计学意义的差异蛋白质峰19个(P<0.05),在ITP组表达上调的蛋白质有5个,下调的蛋白质有14个。软件自动将区分疾病组与对照组能力最强的10个质谱峰建成了一个基于SNN(Supervised Neural Network Algorithm)算法的诊断模型,建模组判断ITP的预期敏感性为100%,预期特异性为100%。应用建立的SNN诊断模型对验证组进行分类验证,20例ITP病例及20例健康对照均被全部正确识别;交叉验证对ITP患者和健康对照检出的正确率为100%。结论:应用具有高通量及良好重复性Clin Prot系统建立的ITP SNN模型由10个显著差异蛋白质峰构成,能有效区分ITP患者与正常对照,而且敏感性和特异性较高。

WCX-MB联合MALDI-TOF MS技术建立宫颈癌诊断预测模型及初步验证

目的:筛选宫颈癌患者血清差异性蛋白/多肽,建立宫颈癌诊断预测模型,寻找宫颈癌潜在肿瘤标志物。方法:收集宫颈癌患者血清标本34例、良性对照组血清标本27例、健康组血清标本26例,按照3∶1随机分为训练组(宫颈癌患者25例、良性对照19例、健康者19例)和验证组(宫颈癌患者9例、良性对照8例、健康者7例)。弱阳离子交换磁珠(WCX-MB)富集低丰度蛋白/多肽,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测得到血清蛋白表达图谱,采用ClinPro Tools 3.0软件筛选差异表达蛋白/多肽峰,建立宫颈癌诊断预测模型并进行验证。结果:筛选出12个具有显著性差异的多肽峰,与健康组相比,9个差异峰在宫颈癌患者中表达上调,3个表达下调。其中多肽峰m/z 4210.90和4645.11的ROC曲线下面积分别为0.97、0.85。采用快速分类算法(QC)建立的宫颈癌诊断预测模型效能最佳,其对癌症组和健康组的诊断准确性为93.75%,特异性为100%,敏感性为88.89%;对癌症组和良性对照组的诊断准确性为88.24%,特异性为75%,敏感性为100%。结论:应用QC建立的宫颈癌诊断预测模型具有较高的诊断效能,可较好地应用于宫颈癌辅助诊断,多肽峰m/z 4210.90和4645.11有望成为诊断宫颈癌的潜在肿瘤标志物。

基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术建立结直肠癌诊断模型及初步验证

目的 基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术建立结直肠癌(CRC)诊断模型,寻找CRC潜在的血清学标志物。方法 收集自2018年12月至2020年12月于联勤保障部队960医院就诊的114例CRC初诊患者(CRC组)和进行体检的60例健康体检者(健康组)的血清标本,按照3∶1的比例随机分为训练组131例(CRC患者87例,健康者44例)与验证组43例(CRC患者27例,健康者16例),分别用于模型的建立和初步验证。应用弱阳离子交换磁珠(MB-WCX)进行血清中低丰度蛋白提取纯化,经MALDI-TOF MS筛选CRC组和健康组中差异蛋白峰;基于3种算法(遗传算法、监督神经网络算法和快速分类算法)建立诊断模型,选取差异最显著的两个蛋白峰做聚类分析,将验证组数据带入诊断模型验证其敏感性、特异性及诊断效率。结果 CRC组与健康组蛋白指纹图谱存在明显差异,共筛选出9个有统计学意义的差异蛋白峰(曲线下面积>0.70),在CRC组表达上调7个,下调2个;其中,m/z 4645.32和m/z 5906.48差异最显著(P<0.01),曲线下面积分别为0.91、0.76;m/z 4645.32在CRC组表达显著下调,m/z 5906.48表达上调。比较发现监督神经网络模型诊断效能最佳,其敏感性为92.60%、特异性为81.25%、准确性为88.37%。结论 本研究建立的CRC诊断模型具有较好的诊断效能,其中,蛋白峰m/z 4645.32和m/z 5906.48有望成为CRC潜在的血清学标志物。