胶原蛋白肽与弹性蛋白肽对改善皮肤光老化的研究进展

皮肤光老化是紫外线通过损伤皮肤真皮层和表皮层而诱导的皮肤衰老,主要体现在3个方面:皱纹与松弛、屏障功能受损及干燥粗糙、色斑与晒斑。由于生活压力和环境污染程度日益增加,现代人群的皮肤衰老速度逐渐加快,如何改善皮肤衰老已经成为了人们的关注热点。胶原蛋白肽(collagen peptide,CP)与弹性蛋白肽(elastin peptide,EP)是由胶原蛋白和弹性蛋白制得的低分子活性肽,能够从上述三方面展现出优良的抗光老化活性。该文对CP和EP制备工艺进行探讨,同时从CP和EP如何减少皱纹、保湿、美白的角度出发,对两种肽抗皮肤光老化的机理进行综述,以期为CP和EP的日常食用及蛋白肽产品的开发提供科学参考。

红霉素可抑制弹性蛋白肽诱导的CD4^+T细胞向Th17细胞分化

目的探讨红霉素对弹性蛋白肽暴露下CD4+T细胞向Th17细胞分化的影响。方法从小鼠脾脏经免疫磁珠分选出CD4+T细胞,随机分为空白对照组、弹性蛋白肽组和弹性蛋白肽加红霉素干预组。弹性蛋白肽组和弹性蛋白肽联合红霉素处理组加入终浓度30μg/mL的弹性蛋白肽,弹性蛋白肽联合红霉素处理组在弹性蛋白肽处理的基础上,另外加入100μg/mL的红霉素。3组细胞在无血清培养液培养24h,用流式细胞术检测Th17的百分比,荧光定量PCR检测维甲酸相关孤儿核受体γt(RORγt)mRNA表达,Western blot法检测核因子κB(p65)[NF-κB(p65)]及信号转导子和转录激活子3(STAT3)蛋白相对含量。结果弹性蛋白肽组CD4+IL-17+细胞的百分比为(11.32±2.34)%、对照组为(5.21±1.36)%;qRT-PCR发现RORγt mRNA表达比对照组明显增加,Western blot法检测发现NF-κB(p65)和STAT3蛋白表达比对照组增强。与弹性蛋白肽组比较,弹性蛋白肽联合红霉素处理组的CD4+IL-17+细胞的百分比、RORγt mRNA表达、NF-κB(p65)和STAT3蛋白表达明显减少。结论红霉素可抑制弹性蛋白肽诱导CD4+T细胞向Th17分化。

弹性蛋白肽在皮肤科应用研究的进展

弹性蛋白肽(elastin-derived peptide,EDP)是弹性蛋白的降解产物,它通过作用于细胞表面的受体——弹性蛋白结合蛋白(elastin-binding protein,EBP)而发挥多种生物学功能,如促进正常细胞和肿瘤细胞蛋白酶的释放、增强肿瘤细胞的侵袭性和促进皮肤损伤的修复等。本文综述了弹性蛋白肽的来源、分类、受体及其在皮肤科领域的研究进展。

弹性蛋白肽对髓样树突状细胞表面共刺激分子表达及炎症因子分泌的影响

目的:探讨弹性蛋白肽(EP)对髓样树突状细胞(mDCs)表面共刺激分子表达及炎症因子分泌的影响。方法:诱导小鼠骨髓来源的单个核细胞增殖分化为未成熟mDCs,随机分为空白对照组和EP组,空白对照组不加任何刺激,EP组加入终浓度为1mg/L EP。分别采用流式细胞术和qPCR技术检测mDCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞上清液中白介素(IL)-6和转化生长因子(TGF)-β1的浓度。结果:流式细胞仪检测EP组CD80和CD86阳性表达率分别为(53.05±2.49)%、(50.05±3.90)%,显著高于空白对照组的(22.38±5.21)%、(19.33±5.80)%(P<0.05)。EP组CD80和CD86mRNA相对表达量及细胞上清液中IL-6和TGF-β水平均较空白对照组明显升高(P<0.05)。结论:EP可促进小鼠mDCs的活化及相关促炎因子的释放。

感染性休克患者血浆弹性蛋白肽水平的变化及其意义

目的观察感染性休克患者血浆中弹性蛋白肽(EP)水平的变化,探讨其在感染性休克期间血流动力学改变中所起的作用。方法采集18例感染性休克患者的血样,同时采集同期住院的36例非感染性疾病患者和18名正常人的血样,采用ELISA技术测量血浆弹性蛋白肽的浓度。结果与非感染性疾病患者及正常人相比,感染性休克患者休克期间血浆EP水平明显增高,而非感染性休克患者与正常人之间差异无统计学意义,感染性休克患者在休克好转后血浆EP水平较休克期间明显降低(P<0.05)。结论感染性休克患者在休克期间血浆EP水平明显增高,增高的EP可能参与了感染性休克血流动力学改变的病理生理过程。

大鲵肉肌基质蛋白中胶原蛋白肽和弹性蛋白肽特性

对大鲵肉肌基质蛋白中提取的胶原蛋白肽和弹性蛋白肽特性进行研究。以大鲵肉肌基质蛋白为原料,分别采用胶原蛋白酶和弹性蛋白酶进行酶解,测定酶解产物光谱特性、氨基酸组成、分子质量、物理特性及体外抗氧化能力。结果表明:胶原蛋白肽和弹性蛋白肽提取率分别为45.11%和37.36%;紫外光谱结果表明,胶原蛋白肽和弹性蛋白肽最大吸收峰分别位于210~230、200~220 nm;红外光谱结果表明,在酰胺A、B、Ⅱ带胶原蛋白肽和弹性蛋白肽均有吸收峰,在酰胺Ⅲ带仅胶原蛋白肽有吸收峰;氨基酸含量测定结果表明,胶原蛋白肽和弹性蛋白肽含有人体7种必需氨基酸,疏水性氨基酸含量较高,芳香族氨基酸含量较低;在分子质量13~150 kDa的Marker标记范围内,观察不到胶原蛋白肽和弹性蛋白肽的电泳条带;黏度测定表明,胶原蛋白肽和弹性蛋白肽具有一定黏性;扫描电子显微镜结果表明,胶原蛋白肽结构呈海绵状,片状较大,弹性蛋白肽结构呈大小不一的碎片状,结构松散,均有一定的抗氧化能力,且抗氧化能力与多肽质量浓度呈正相关。

疏水类弹性蛋白多肽的克隆表达及相变特性分析

类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELPs)作为新型温敏生物材料,在药物递送、组织工程和蛋白质分离纯化领域具有广阔的应用前景,精确控制快速生物合成具有特定相变特性的ELPs至关重要。利用质粒重建递归定向连接技术,成功构建以缬氨酸为客座氨基酸的重组质粒pET28-ELP 25、pET28-ELP 50和pET28-ELP 100,分别转化至Escherichia coli BL21(DE3)中,经自诱导培养基的培养,SDS-PAGE结果表明,ELPs在大肠杆菌体系中实现了胞内可溶过量表达,表达量约占胞内全细胞蛋白的30%以上。利用可逆相变循环法(inverse transition cycling,ITC)进行分离纯化,仅需3轮ITC获得电泳纯ELP 25、ELP 50和ELP 100。热比浊法测定相变温度,分析显示ELPs的相变温度与多肽浓度、离子强度和多肽分子量均呈负相关,为进一步重组克隆表达特定相变特性的温敏多肽生物材料奠定理论基础。

载奥沙利铂类弹性蛋白多肽水凝胶的制备及其对小鼠结肠癌CT26细胞的杀伤作用

目的:制备担载奥沙利铂(OXA)的类弹性蛋白多肽(ELPs)水凝胶,研究其体外药物释放情况及对小鼠结肠癌CT26细胞的杀伤作用。方法:利用大肠杆菌(E.coli)系统表达ELPs原核蛋白,利用可逆相变循环法(ITC)进行蛋白纯化,将ELPs蛋白溶液与交联剂四羟甲基氯化磷(THPC)混匀制备水凝胶,扫描电子显微镜(SEM)观察水凝胶的超微结构,CCK-8法检测不同浓度ELPs水凝胶处理后CT26细胞和小鼠成纤维NIH3T3细胞存活率,活/死细胞染色法观察30和40 g∙L-1 ELPs水凝胶作用48 h后CT26细胞存活情况。制备载OXA的ELPs水凝胶,检测其在不同pH值(6.5和7.4)缓冲液中的药物释放情况,CCK-8法检测加入载不同浓度(0.25、1.00、4.00、16.00和64.00 mg∙L-1)OXA的ELPs水凝胶浸泡液后各组CT26细胞存活率和处理不同时间各组CT26细胞存活率。结果:凝胶电泳分析,E.coli诱导后在预计相对分子质量38000附近出现明显加粗的蛋白条带,ITC纯化后泳道中无明显杂蛋白存在。ELPs蛋白溶液中加入THPC后由透明液体状态转变为不透明的白色水凝胶,SEM观察显示出排列整齐的孔隙和三维结构;CCK-8法检测,经不同浓度ELPs蛋白处理后CT26细胞和NIH3T3细胞存活率仍接近100%;活/死细胞染色,ELPs水凝胶处理后的CT26细胞在荧光显微镜下呈现明亮的绿色荧光。载OXA的ELPs水凝胶能在体外持续释放OXA,在pH值6.5条件下OXA的释放速度较pH值7.4条件下稍快;CCK-8法检测,载不同浓度OXA的ELPs水凝胶浸泡液呈剂量依赖性抑制CT26细胞增殖,且随孵育时间的延长CT26细胞存活率逐渐降低。结论:载OXA的ELPs水凝胶具有持续释放OXA的特性,能够高效且持续地杀伤小鼠结肠癌CT26细胞,可作为一种安全有效的药物递送载体用于抗肿瘤研究。

类弹性蛋白多肽在给药系统中的应用研究进展

类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELPs)是一种人工基因工程化多肽聚合物,主要由五肽重复序列单元串联而成。它对环境温度非常敏感,具有可逆温敏相变特征,加之良好的生物相容性、生物降解性及可高通量制备等优势,使其在生物医药领域展现出广阔的应用前景。本文参考国内外ELPs研究的主要文献,就其相变特性、载药潜能、载药方式及其在给药系统中的应用等方面进行综述。

类弹性蛋白多肽黏膜下注射在黏膜剥离术中应用的实验研究

目的将类弹性蛋白多肽(ELP)作为一种黏膜下注射液应用于内镜黏膜下剥离术(ESD),对其有效性进行评估,为临床应用提供依据。方法 54只雄性SD大鼠随机分为3组(n=18)。第一组观察不同注射液分离组织的有效性。根据注射不同的注射剂随机分为3个亚组(n=6),暴露胃后壁分别黏膜下注射ELP、透明质酸钠(SH)和生理盐水(NS)0.2mL,观察并记录药物注射后0、5、10、30及60min局部黏膜隆起厚度及黏膜表面的改变;第2组观察注射不同注射液后30min黏膜隆起的组织学表现(n=6);第3组观察黏膜下剥离时不同注射液对出血的影响。根据注射不同注射剂随机分为3个亚组(n=6)。给予上述注射剂处理后,用无菌手术刀片完整切除黏膜下注射后形成的隆起部位,测定黏膜切除20min内的出血量。结果注射药物后60min内黏膜隆起厚度比较:ELP组分别与SH和NS组相比差异有显著性(P<0.05),即ELP维持黏膜隆起厚度明显大于SH和NS;SH与NS组相比差异有显著性(P<0.05),即SH维持黏膜隆起厚度大于NS。组织学观察ELP注射部位的周围组织中未见明显的炎性细胞浸润及坏死。黏膜切除时的出血量:ELP组、SH组、NS组分别为(854.0±98.9)、(726.3±104.8)和(1144.0±112.4)mg,ELP、SH组分别与NS组相比差异有显著性(P<0.05),应用ELP与SH较NS可明显减少出血量。结论黏膜下注射ELP后,ELP在黏膜下组织中的弥散明显延缓,在黏膜下形成较持久的液体垫维持黏膜厚度,有利于黏膜组织的剥离切除,并可以减少出血量,因此ELP有可能作为ESD中较为理想的黏膜下注射剂应用于临床。

载多西他赛温敏类弹性蛋白多肽自组装微粒的制备

目的:制备温敏类弹性蛋白多肽(ELPs)自组装微粒,并考察其温敏特性及对模型药物多西他赛的包载效能。方法:将ELPs冻干粉重新分散于冷的NaCl磷酸盐缓冲液中,利用配备电热温控装置的紫外-可见分光光度计,在波长350nm处测定ELPs溶液的光密度,升降温速率为1℃/min,计算相变温度。向ELPs溶液中加入多西他赛50%乙醇水溶液,混合完全,相变温度下孵育30min即得载药微粒,保温离心测定包封率并考察体外释放情况。结果:相变温度下自组装形成的载药微粒外观圆整,粒径约为1μm,包封率可达15.12%。结论:ELPs具有温敏特性,且可实现对多西他赛的包载。

氨基酸对类弹性蛋白多肽产量的影响

采用谷氨酰胺来确定氨基酸初始添加浓度,分析各种氨基酸对类弹性蛋白多肽[KV8F-40]产量的影响.结果表明:苏氨酸、精氨酸和半胱氨酸都能较大提高产量,其中以苏氨酸最为明显,产量可达126.9mg·L-1,比对照增加54.0%.利用响应面设计对上述3种氨基酸进行3因素3水平实验,经优化后所得理论最大产量为100.3mg·L-1.经实验验证,所得实验值为103.1mg·L-1,与理论值吻合,但其产量低于单个氨基酸.交互作用分析表明:3种对产量有促进作用的氨基酸之间没有互作或者存在拮抗作用.

具有皮肤美容应用潜能的透皮型弹性蛋白样多肽的制备

目的:设计、制备透皮型弹性蛋白样多肽(elastin-like polypeptide,ELP)融合蛋白,探索其作为皮肤美容制剂的潜能。方法:设计具有透皮特性的蛋白转导功能域(protein transduction domain,PTD)和ELP融合蛋白PTD-ELP,联合密码子优化、重叠延伸PCR和定向递归连接等技术构建其原核表达载体。在此基础上将该载体转化至大肠杆菌中,进行异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导表达并对目标蛋白的亚细胞定位和可溶性进行分析。结果:成功构建了携带PTD-ELP读码框架的原核表达载体,携带该载体的大肠杆菌在IPTG诱导5h时PTD-ELP融合蛋白的表达量达到峰值,约占菌体总蛋白的23.6%;亚细胞定位分析表明PTD-ELP融合蛋白主要以包涵体形式在胞内表达。结论:成功设计并构建了能够表达PTD-ELP融合蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中实现了其高效表达,为深入探讨PTD介导的ELP透皮给药在逆转皮肤衰老和预防、治疗光老化中的应用奠定了基础。

肺弹性蛋白降解肽段人工抗原的合成与鉴定

目的制备和鉴定肺弹性蛋白降解肽段人工抗原,为进一步研制慢性阻塞性肺疾病(COPD)免疫检测试剂盒打下良好基础。方法以Sulfo-SMCC为偶联剂,钥孔血蓝蛋白(KLH)为载体蛋白制备免疫原;经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)电泳鉴定偶联情况;以免疫原免疫Balb/c小鼠制备特异性抗体,间接竞争酶联免疫吸附实验(ELISA)法评价抗血清效价及特异性。结果紫外扫描和SDS-PAGE电泳确认了肺弹性蛋白降解肽段人工抗原合成成功,其蛋白浓度为1.181mg/mL,抗血清效价高于1∶64 000,IC50为13.7ng/mL,抗血清与无关肽段无交叉反应。结论本实验成功制备了肺弹性蛋白降解肽段人工抗原,其具有较好的免疫原性,为建立快速准确检测COPD免疫检测方法奠定基础。

溶剂特性对三臂星型类弹性蛋白多肽相变温度的影响

本文利用Spy Tag/Spy Catcher特性构建了三臂星型结构的类弹性蛋白多肽（elastin-like polypeptides,ELPs）,考察其在不同溶剂,如分子拥挤试剂、osmolytes及深共熔溶剂（deep eutectic solvents,DESs）中的相变温度及行为,并与含有相同ELPs重复数的线性ELPs120作对比。结果表明：在不同浓度拥挤试剂PEG2000作用下,两种结构的ELPs相变温度均降低,当其各自浓度均为25μmol/L时,三臂星型ELPs相变温度降低3℃-13℃,而ELPs120相变温度仅降低1.5℃-10.8℃。此外,在添加PEG2000后,三臂星型ELPs相变缓慢;在不同类型和浓度的osmolytes溶液中,25μmol/L三臂星型ELPs相变温度明显要比线性ELPs高8℃左右;在DESs体系中,三臂星型ELPs有类似与水溶液中的相变行为,且其相变温度受到抑制,另外三臂星型ELPs和ELPs120在DESs/PBS体系中,与在（氯化胆碱＋尿素）/PBS体系中的相变行为一致,其中当DESs体积含量为50%,ELPs120相变温度是最低的。由于ELPs在非单一缓冲液体系中的相变行为不同,这丰富了ELPs作为纯化标签的应用,且在非单一缓冲液体系中因降低了相变温度,节约了纯化融合蛋白的经济成本,同时也为研究ELPs拓扑结构与其相变行为之间的关系奠定理论基础。

类弹性蛋白多肽及其应用研究进展

类弹性蛋白多肽是一类由VPGXG五肽重复序列串连而成的人工多聚物。其具有在一定温度范围内发生可逆相转变特性,同时具有较好的生物相容性和生物可降解性,使其广泛应用于生物、医学、环境等方面。本文概述类弹性蛋白多肽的相转变特性及其机理,命名分类,并重点阐述其在药物载体、组织工程、免疫测定、影像学等方面的应用。

类弹性蛋白多肽的原核表达与纯化

目的构建类弹性蛋白多肽(ELPs)的表达质粒并获得类弹性蛋白多肽。方法构建含ELPs的原核表达载体,转化E.coli BL21感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导ELPs蛋白表达并对其进行纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度。结果成功构建pET-28a-ELPs原核表达载体,在相对分子质量55 000处出现目的条带,与目的蛋白分子量大小一致,蛋白纯度为95%。结论成功表达并纯化出ELPs蛋白,为ELPs在组织工程方面的应用奠定了基础。

ELP-SOD融合蛋白的纯化及其脂质体制备

目的:通过重组E.coli细胞表达类弹性蛋白多肽超氧化物歧化酶(elastin-like polypeptides-superoxide dismutase,ELP-SOD)融合蛋白,利用ELP蛋白有温度敏感的相变特性,经过三轮可逆相变循环(ITC)获得高活性的纯化ELP-SOD酶。结合脂质体包裹技术制备具有较长半衰期和酶活性的ELP-SOD脂质体,为重组人源SOD在医疗、保健、化妆品等领域的应用奠定基础。方法:利用SDS-PAGE及Tanon3500凝胶成像系统、Image studio软件对ELP-SOD进行纯度检测;采用改良的邻苯三酚自氧化法(325 nm法)测定SOD融合蛋白的酶活性;调节不同的pH值及温度梯度测定融合蛋白的pH稳定性及热稳定性;添加Cu^(2+)/Zn^(2+)提高ELP-SOD酶活性;以大鼠血浆进行模拟体内半衰期实验;用不同浓度ELP-SOD的培养基分别与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和小鼠成纤维细胞(L929细胞)孵育来验证细胞毒性;薄膜水化法制备ELP-SOD脂质体并测定其包封率;制备小鼠离体皮肤,采用TP-6透皮扩散仪进行体外释放实验,用Franz扩散池考察ELP-SOD脂质体运载ELP-SOD的透皮效率。结果:ELP-SOD融合蛋白的最高表达量为10 mg/L,纯度为97.8%,酶比活为4894.5 U/mg;其在pH 5.0~8.0、温度低于60℃时稳定性较高;ELP的接入对于SOD的半衰期有一定的延长作用,且有较好的生物安全性;ELP-SOD脂质体的包封率达到80%以上,能够进一步延长ELP-SOD的半衰期,且其透皮效率明显高于ELP-SOD。结论:通过可逆热相变性技术简化了ELP-SOD融合蛋白纯化步骤,并结合脂质体制备技术,延长了酶蛋白生物半衰期,提高了生物利用度。

含RGD肽类弹性蛋白制备及促HUVECs细胞黏附的影响

目的探讨含RGD肽的类弹性蛋白多肽RGD-ELPs和RDG-ELPs与细胞相容性及两种融合蛋白对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)黏附的影响.方法应用大肠杆菌系统表达RGDELPs和RDG-ELPs蛋白,利用可逆相变循环(ITC)纯化两种融合蛋白;通过MTT法及活/死细胞染色法检测两种融合蛋白与人胚肾细胞(HEK293T)的相容性;通过贴壁细胞计数方法检测不同浓度RGD-ELP对体外HUVECs细胞黏附表达的影响.结果利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统制备高浓度的RGD-ELPs和RDGELPs,通过ITC纯化得到了高纯度融合蛋白;MTT法及活/死细胞染色法结果提示RGD-ELPs和RDG-ELPs蛋白具有良好的相容性;细胞黏附实验结果表明:RGD-ELPs浓度越大,HUVEC细胞黏附能力越强,而对照组RDGELPs则未显示出明显的细胞黏附效果.结论成功表达并纯化了RGD-ELPs和RDG-ELPs融合蛋白;两种蛋白均具有良好的细胞相容性;RGD-ELPs蛋白具有明显的促进HUVECs细胞黏附作用.

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELPmCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELPmCherry融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry融合蛋白进行纯化;通过MTT法探讨ELPmCherry融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果DNA测序结果显示成功构建了ELP-mCherry原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry融合蛋白,通过ITC法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT结果表明:在所有ELP-mCherry蛋白测试浓度下,HEK293T和NIH3T3细胞存活率接近或超过100%.结论成功构建ELP-mCherry原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry融合蛋白,ELP-mCherry融合蛋白在HEK293T和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性.