基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法

为了建立一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)检测方法,研究基于CRISPR-Cas13a系统并结合多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)技术建立了一种MSRV的检测方法。实验对MSRV序列进行多重序列比对分析后,针对MSRV衣壳蛋白(CP)基因的特异性区域设计两个靶点,并通过体外转录成特异性的crRNA,同时设计合成MIRA引物序列实现目标序列的等温扩增,最后结合Cas13a蛋白、crRNA、恒温扩增体系构建检测体系,并从高效crRNA的选择、反应温度、ssRNA报告探针浓度和Cas13a与crRNA的浓度比四个方面优化了反应体系,并采用最优检测体系对大口黑鲈样本进行检测验证。结果显示,在20μL检测体系中加入200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2及500 nmol/L ssRNA报告探针,在37℃的情况下能够获得最佳的检测效果。并且该检测体系可以检测到102 fM的MSRV病毒,具有良好的特异性和灵敏性,此外检测结果可直接通过紫外灯照射直接观察。研究基于CRISPR/Cas13a系统结合等温扩增MIRA技术建立的MSRV检测方法,可在室温下且不需要昂贵的仪器进行MSRV病毒检测,检测结果可以肉眼直接观察,能在多种场合下使用,研究结果为检测MSRV提供了有效方法。

鳜弹状病毒N蛋白与鳜c-Myc互作调控谷氨酰胺代谢机制

为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc(Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制,本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白,初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白);Co-IP结果显示,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在相互作用。通过PCR扩增获得了带有Flag标签序列的SCRV-N基因的ORF片段,并构建了SCRV-N蛋白过表达载体pcDNA-N-Flag;将pcDNA-N-Flag质粒转染鳜脑组织细胞系(CPB细胞系),荧光共定位结果显示,Sc-c-Myc与SCRV-N在细胞质内存在共定位现象;通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫印记(Western blot)检测转染pcDNA-N-Flag的CPB细胞系中Sc-c-Myc及谷氨酰胺代谢通路关键酶(GLS1、GDH和IDH2)的表达变化,发现Sc-c-Myc、GLS1的转录水平和蛋白水平均显著上调。综上表明,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc互作促进Sc-c-Myc的表达,进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢途径,为SCRV防控提供了新的靶点。

抗大口黑鲈弹状病毒发酵中草药的筛选及其效果评价

为筛选出能够对MSRV具有抑制效果的发酵中草药,研究通过MTT法检测8种发酵中草药(L1、L2、L3、L4、L5、X1、X2和ZHS)对EPC细胞的毒性作用,结果表明L1、L2、L3、X1、X2和ZHS未对EPC细胞造成明显的损伤和毒性,L4和L5在4 mg/mL时对细胞造成损害;通过荧光定量PCR法(qRT-PCR)筛选出X1药物(主要成分为板蓝根、鱼腥草、南芪和杏仁)对MSRV有良好的抗病毒效果;在细胞水平上通过qRT-PCR法发现X1药物能够抑制MSRV的感染;空斑实验结果表明X1药物可以降低约10倍MSRV的病毒滴度。在鱼体水平上设置空白对照组、药物对照组、攻毒组、预防组和治疗组,评价X1药物对MSRV的抗病毒效果,结果表明经X1药物处理后,治疗组可以将大口黑鲈的存活率提高20%;通过qRT-PCR法检测大口黑鲈组织中病毒载量,结果表明X1药物显著抑制MSRV在肝脏、脾脏组织中的复制;通过组织病理学观察发现X1药物可以抑制MSRV引起的在肝脏、脾脏组织病变。研究为发酵中草药在水产养殖中的应用提供新的思路,为开发抗MSRV药物提供参考依据。

鳜弹状病毒糖蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入杆状病毒穿梭载体pFastBac1中转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后,筛选阳性克隆获得重组转移载体pFastBac-G,再将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑与抗性筛选后获取重组杆粒rBacmid-G,随后利用脂质体转染法将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒。将获取到的P3代重组病毒感染Sf9昆虫细胞进行重组蛋白的SDS-PAGE检测,成功表达后利用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,随后对重组蛋白进行Western blot鉴定,结果显示在大于50 ku处有一条特异性条带,而对照组无条带,表明制备的抗原能与抗体特异性结合。结果表明,鳜弹状病毒糖蛋白G在杆状病毒表达系统成功表达。本试验结果可为鳜弹状病毒糖蛋白G疫苗的研发和大规模生产提供技术支撑。

加州鲈弹状病毒病发生原因及防控技术

伴随着加州鲈养殖规模的逐步扩大,不断暴发的各种病害成为加州鲈产业发展的制约因素之一。其中加州鲈弹状病毒病是养殖中的一种常见病毒病,其发病快、死亡率高,对加州鲈产业造成很大的损失。一、弹状病毒病发生原因通过对加州鲈近年来的发病情况分析可以发现,加州鲈弹状病毒病的发病水温一般为25~28℃。加州鲈弹状病毒病的暴发,常常与以下几个因素有直接关系。

抗杂交鳢(Channa argus×C.maculate)弹状病毒卵黄抗体制备及ELISA检测方法的建立

为确定杂交鳢(Channa argus×C.maculate)弹状病毒卵黄抗体效价水平消减规律并验证抗体对病毒的中和能力,采用杂交鳢弹状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡,使用醋酸-醋酸钠-辛酸法制备卵黄抗体,建立间接ELISA检测方法以监测卵黄抗体产生过程抗体水平消减情况,以中和试验评估卵黄抗体中和杂交鳢弹状病毒效果。结果显示,ELISA检测方法最佳条件为抗原包被浓度0.5×105.8TCID_(50)/0.1 mL,37℃包被2 h,37℃封闭2 h。与大口黑鲈蛙虹彩病毒卵黄抗体、SPF蛋黄提取物、免疫前蛋黄提取物以及MBC空细胞均无交叉反应。以S/N(sample/negative)>2.1且敏感性最高为标准确定阳性、阴性样品。卵黄抗体于首免后28 d产生效价,四免后达到最高水平,效价为1︰25600,平台期可持续40~60 d,通过中和抗体检测结果证明平台期内抗体中和效价在免疫周期内最高,约为46.3。通过ELISA检测方法对卵黄抗体产生规律进行监测,通过中和检测方法评估卵黄抗体中和病毒效果。高滴度卵黄抗体具有被开发为新型抗杂交鳢弹状病毒生物制品的潜力,杂交鳢弹状病毒卵黄抗体的制备及快速检测方法的构建为该病的防治提供了理论基础和技术手段。

大口黑鲈弹状病毒G蛋白胞外区原核表达及多克隆抗体制备

【目的】获得能特异性识别大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV)G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV双抗夹心法胶体金试纸条的研制提供材料。【方法】根据GenBank上MSRV G蛋白的基因序列(GenBank登录号:OK272491.1)设计扩增其胞外区的特异性引物,以感染MSRV的GS细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增获得目的序列,双酶切后连接至pET-28a(+)表达载体构建重组质粒pET-28a-ΔG,将重组质粒转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞。挑取测序正确的阳性克隆提取重组表达质粒pET-28a-ΔG,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,再次挑取阳性克隆,测序正确后用IPTG诱导表达。目的蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫BALB/c雌性小鼠,4次免疫后眼眶采血获得抗MSRV G蛋白的多克隆抗体,最后通过ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR结果显示,获得大小为1 323 bp的目的条带。SDS-PAGE结果显示,构建的重组表达质粒可高效表达目的蛋白,Ni柱纯化后获得单一目的蛋白,分子质量在48.5 ku左右,与预期相符,且纯度符合免疫原要求。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别不同批次的MSRV G蛋白。IFA结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别天然状态下的G蛋白。【结论】本研究利用MSRV G蛋白的胞外区重组蛋白成功制备出能特异性识别MSRV G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV的免疫检测和疫苗开发奠定了基础。

珠三角地区杂交鳢(乌鳢♂×斑鳢♀)弹状病毒感染状况调查

【目的】杂交鳢(Hybrid snakehead)为我国重要的特种水产鱼类,为摸清杂交鳢弹状病毒(Hybrid snakehead rhabdovirus,HSHRV)的感染状况,2021年3月至2022年2月对珠三角地区养殖的杂交鳢弹状病毒病展开调查。【方法】对繁育阶段的杂交鳢亲本、鱼苗、水样进行随机采样;养殖阶段则选择固定时间进行随机采样,并在病害暴发时采样。监测周期内共采集333份样品,每尾鱼经无菌解剖后,取绿豆大小肝脏、脾脏和肾脏组织混样,保存于液氮中,用于提取RNA;以反转录的cDNA为模板,采用qPCR技术进行HSHRV检测。【结果】感染HSHRV的鱼体主要临床症状为不规则游动、打转,体表无明显症状,解剖可见肝脏、脾脏、肾脏、肠道和鱼鳔充血发红或肿大;qPCR检测结果显示,333份样品的HSHRV平均阳性率为13.21%,阳性样品主要集中在4-11月,其中,8月份的样品阳性率高达23.91%;养殖阶段的HSHRV平均阳性率(17.01%)显著高于繁育阶段的平均阳性率(3.26%);从鱼体规格来看,HSHRV最易感10cm以内的鱼,阳性率高达32.20%,主要在3-9月检出;HSHRV最不易感20 cm以上的鱼,阳性率低至9.52%。【结论】明确了繁育阶段和养殖阶段以及不同养殖规格杂交鳢的HSHRV阳性率,为深入了解杂交鳢弹状病毒病的流行规律提供参考,以期为养殖过程中杂交鳢弹状病毒病的预防与控制提供数据支撑。

中国植物弹状病毒研究进展

弹状病毒含有单链负义RNA基因组,寄主范围比较广泛,能侵染无脊椎动物、脊椎动物以及植物等寄主,对人类的健康、农作物产量和自然生态系统造成严重威胁。植物弹状病毒主要根据复制场所分为细胞质弹状病毒属Cytorhabdovirus和细胞核弹状病毒属Nucleorhabdovirus,其基因组由单股负链RNA组成。此外,Dichorhavirus和Varicosavirus病毒属是两个新鉴定的植物弹状病毒属,其特征是具有二分体基因组。本文着重介绍危害我国农作物的几类植物弹状病毒,对它们的病理学、病害流行、基因组信息以及传播媒介进行概述,为中国植物弹状病毒病害的研究提供理论依据。

一株鳢科鱼源弹状病毒的分离及鉴定

为研究近来鳢科鱼类疫病频发的病因,实验对采集的患病杂交鳢病料分别从细菌学和病毒学两方面进行病原分离和鉴定。排除细菌感染的可能后,通过细胞培养技术、回归感染实验、电镜技术、分子生物学技术等进行病毒学分析,最终分离到一株弹状病毒,命名为HSHRV-C1207(Hybrid Snakehead Rhabdovirus-C1207)。实验结果显示,该病毒在EPC、FHM、GSB、SFC、CIK等8种细胞中都能复制,并对其中6种细胞产生明显的细胞病变效应(CPE)。用分离的病毒进行回归感染实验,可使感染的杂交鳢复制出自然发病鱼的相同症状,且死亡率达90%。感染病料组织液的EPC细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量子弹状病毒聚集,直径约60 nm,长度约为160 nm,形态和排列方式与已报道的鱼类弹状病毒相似。参考OIE中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的检测引物及根据乌鳢弹状病毒(SHRV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、比目鱼弹状病毒(HIRRV)的G蛋白基因设计特异性引物,分别对自然发病病料组织、接种病料组织的细胞进行RT-PCR扩增,仅针对SCRV的引物能扩增出大小约350 bp的片段。对HSHRV-C1207株的G基因进行序列测定和分析,结果表明其核苷酸序列同SCRV和SHRV的同源性分别为93.8%和20.4%,推导的氨基酸序列同源性分别是93.7%和18.3%。用G基因推导氨基酸序列与其它弹状病毒的G蛋白进行系统进化树分析,表明该毒株与水泡性病毒属聚为一支,其中与SCRV的亲缘关系最近,而与属于诺拉弹状病毒属的SHRV相距甚远,可能为SCRV的变异株或一个新的毒株。

石鲽鱼鱼苗中一种弹状病毒的分离与鉴定

从养殖石鲽鱼(Kareius bicoloratus)鱼苗中分离到1株弹状病毒(080113株)。用研磨离心除菌后的组织匀浆液,接种11种鱼类细胞系。结果在鲤上皮瘤细胞(EPC)和肥头鲤细胞系(FHM)等8种细胞中均出现明显的细胞病变(Cytopathic effect,CPE),在鲤上皮瘤细胞(EPC)中的滴度最高。对该毒株的理化性质进行了测定,结果显示080113株对温度和pH敏感;对5′-碘-2′脱氧尿密啶(I UDR)不敏感;对氯仿敏感,提示是一种有囊膜的RNA病毒。制备电镜超薄切片,观察到在细胞质中有大小为(80～118)nm×(28～55)nm、形态为典型的弹状的病毒粒子。SDS-PAGE电泳分析该毒株的蛋白质图谱,结果表明该毒株有5条主要的蛋白带,相对分子质量大小分别为200 000、56 000、42 000、29 000和24 000。用传染性造血器官坏死病毒(I HNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和牙鲆弹状病毒(HRV)等水生动物弹状病毒特异性引物对该毒株进行逆转录聚合酶链式反应,结果用HRV的引物能扩增出阳性片段。对该片段进行测序分析,发现与HRV的参考序列有99%以上的相似性。因此,初步鉴定该毒株为牙鲆弹状病毒。

大口黑鲈弹状病毒的分离培养及其卵黄抗体的制备

本研究从爆发性死亡的大口黑鲈(Micropterus salmoides)鱼苗病样中分离培养1株大口黑鲈弹状病毒(M.salmoides rhabdovirus,MSRV)毒株,采用甲醛灭活大口黑鲈弹状病毒,制备佐剂灭活疫苗,免疫产蛋鸡,收集高免蛋,制备MSRV卵黄抗体,测定其效价、中和效果及对病毒复制和宿主细胞内凝集素基因(intelectin)表达的影响。结果显示,成功利用草鱼(Ctenopharyngodon idellus)卵巢细胞株CO细胞分离培养大口黑鲈鱼弹状病毒,并用于佐剂灭活疫苗的制备;MSRV佐剂灭活疫苗免疫蛋鸡,成功获得MRSV的卵黄抗体,效价为1∶256,稀释度为1∶64时的中和病毒的作用最为明显,中和作用率达38.29%以上,病毒核酸拷贝数明显降低。同时,还可上调细胞内凝集素的表达。研究表明,特异性卵黄抗体对大口黑鲈弹状病毒具有明显的中和效果,为后续卵黄抗体作为免疫制剂的应用奠定了基础。

池塘养殖斑鳢弹状病毒的分离与初步鉴定

从患暴发性死亡的斑鳢病灶中分离出一株弹状病毒。取病鱼肝、脾、肾组织过滤液接种EPC、FHM细胞,连续传至第3代后28℃培养35h出现细胞病变(CPE),测得病毒半数细胞感染量为10 5.746/0.1 mL。将病变细胞制成超薄切片,透射电镜下观察到细胞质中存在大量呈子弹状的病毒颗粒,大小约53 nm×140 nm。用上述组织过滤液及F3代细胞培养病毒液回归感染健康斑鳢均能显示与自然发病鱼相似的症状,死亡率达100%。根据鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)N蛋白保守序列设计的引物对斑鳢病毒的基因组RNA进行RT-PCR扩增,得到大小约400 bp的阳性片段。对该片段克隆、测序后与GenBank中序列进行BLAST比对,发现该基因序列与SCRV同源性最高,为94%。选取GenBank中已登录的病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鳢弹状病毒(SHRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、狂犬病毒(RV)、牙鲆弹状病毒(HIRRV)相关序列构建系统进化树,结果表明,该基因序列与SCRV聚为一支。由于该病毒粒子的形态大小与SCRV(100 nm×200 nm)存在一定差异,暂将其命名为斑鳢弹状病毒(CHRV)。

牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有3尾感染HRV,与病毒分离结果一致,说明LAMP方法比较适合牙鲆弹状病毒的早期及现场诊断。

牙鲆一株弹状病毒病原的分离与鉴定

从患病牙鲆中分离鉴定了一株弹状病毒(Paralichthys olivaceus rhabdovirus,PoRV)。用过滤除菌后的患病牙鲆组织匀浆液,接种不同的鱼类细胞,其中有7种鱼类细胞出现明显的病变在对病毒进行挑斑分离后,测定了PoRV的滴度,显示PoRV在敏感鱼类细胞(Grass Carp Ovary,GCO)中的滴度达到106.5TCID50/mL;绘制了PoRV生长曲线;经蔗糖密度梯度离心提纯PoRV,负染及宿主细胞超薄切片的电镜观察,显示PoRV大小约为60nm×200nm。测定了PoRV的理化性质,显示该病毒对有机溶剂和温度敏感,但对DNA抑制剂阿糖胞苷(Ara-c)不敏感。经SDS-PAGE电泳,对PoRV的蛋白图谱进行了分析,表明该病毒有5种主要蛋白带,其分子量大小分别约为:250kD、67kD、44kD、30kD、23kD。

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。

基于CPB细胞扩增体系的鳜弹状病毒增殖条件的优化

为获知鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)QY株在体外培养细胞中最适增殖条件,以鳜脑细胞系(Chinese perch brain cell line,CPB)为增殖体系,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术所测病毒拷贝数为判断指标,比较同步接毒和异步接毒2种接种方式以及病毒接种量、血清浓度等培养条件对病毒增殖的影响,确定SCRV-QY株在CPB细胞中的最适增殖条件。结果显示,单位体积病毒增殖量方面,异步接毒法优于同步接毒法,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10将病毒接种长满单层的CPB细胞中,28°C吸附1.5 h,用含2%胎牛血清的L15培养液于28°C培养时,病毒增殖量最高,为5.59×10^(10)拷贝/mL;而从单位成本所获病毒量考虑,同步接毒法筛选出的4种增殖条件单位成本所获的病毒产量优于异步接毒法,其中当MOI=0.03、胎牛血清终浓度为6%时,同步接种对数生长中期的CPB细胞,28°C恒温培养70 h后收获病毒液,单位成本所获病毒量最高,为4.88×10^(13)个拷贝/元。综上所述,本研究以病毒增殖量和培养基成本作为考量,优化SCRV-QY株的增殖条件,可为SCRV疫苗低成本、规模化生产提供理论依据。

中国本溪虹鳟一株弹状病毒的分离及初步研究

１９９０年４月，辽宁省本溪市虹鳟鱼种场的虹鳟稚鱼爆发大规模疾病，死亡率近１００％。取病鱼组织处理后接种于鱼类细胞，出现明显的细胞病变，测定细胞培养物中的病毒滴度，最高达１０￣（６．３）ＴＣＩＤ＿（５０／０．１ｍｌ）。感染病毒的细胞用１％营养琼脂糖覆盖后可形成０．５－１．５ｍｍ的蚀斑。分离到的病毒对氯仿敏感，不耐热、不耐酸，在细胞内复制的最适温度为１５℃。室内人工感染的虹鳟稚鱼能复制出与天然发病相同的症状。对感染病毒的细胞制成超薄切片，透射电镜观察，病毒长为１３１－１７３ｎｍ，平均１４８ｎｍ，直径为５８－９１ｎｍ，平均７１ｎｍ，形状为子弹状，表明是弹状病毒，有囊膜及纤突。采用挑斑法得到了纯化的病毒株，暂称之为传染性造血器官坏死症病毒中国本溪株ＩＨＮＶ－Ｂ。

鱼类弹状病毒分子生物学研究动态

鱼类弹状病毒(Fishrhabdovirus)是一类引起鱼及其他水生动物致死性和流行性病害的重要病毒病原。对鱼类弹状病毒基因组的结构和功能研究,是深入探讨这类病毒感染和致病机理、研制病毒疫苗及诊断试剂的理论基础。本文就鱼类弹状病毒的基因组结构,包括N基因、P基因、M基因、G基因、NV基因、L基因及编码的相应蛋白、3'前导区和5'拖尾区、基因连接区等的组成及功能的研究进展作一综述,旨为抗病毒疫苗的研制及建立准确高效的检测方法提供借鉴。

鳜蛙病毒及鳜弹状病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立可以同时检测鳜蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的SCRIV MCP基因和SCRV N基因序列保守片段分别设计特异性引物,将扩增的MCP基因和N基因分别克隆于pEASY-T1载体,构建重组质粒标准品p-SCRIV和p-SCRV,通过优化退火温度和引物浓度建立了可以同时检测SCRIV(400 bp)和SCRV(280 bp)的双重PCR方法。利用该方法对传染性胰坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、锦鲤疱疹病毒、新加坡石斑鱼虹彩病毒、神经坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、罗非鱼湖病毒及鲤春病毒血症病毒等鱼类常见病毒均无扩增条带,而仅对SCRIV和SCRV有特异性扩增条带,特异性较强;该方法对p-SCRIV的检测下限是1 000拷贝/μL,对p-SCRV检测下限是430拷贝/μL,敏感性较高。对21份临床样品的检测结果表明该双重PCR方法的扩增结果与单一PCR扩增结果一致,二者的符合率为100%。本研究建立的双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较高,可以用于上述两种病毒的快速鉴别检测和分子流行病学调查。