一例鲈鱼弹状病毒、柱状黄杆菌和嗜水气单胞菌混合感染的诊治

2023年10月末沈阳市一鲈鱼养殖场新进鲈鱼苗发病,临床主要以烂鳃、烂身、烂尾为主要症状,经流行病学调查结合剖检、实验室检测,最终确诊此次发病主要为弹状病毒感染继发柱状黄杆菌和嗜水气单胞菌混合感染引起,并对该场给出了防治建议。

鳜弹状病毒N蛋白与鳜c-Myc互作调控谷氨酰胺代谢机制

为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc(Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制,本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白,初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白);Co-IP结果显示,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在相互作用。通过PCR扩增获得了带有Flag标签序列的SCRV-N基因的ORF片段,并构建了SCRV-N蛋白过表达载体pcDNA-N-Flag;将pcDNA-N-Flag质粒转染鳜脑组织细胞系(CPB细胞系),荧光共定位结果显示,Sc-c-Myc与SCRV-N在细胞质内存在共定位现象;通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫印记(Western blot)检测转染pcDNA-N-Flag的CPB细胞系中Sc-c-Myc及谷氨酰胺代谢通路关键酶(GLS1、GDH和IDH2)的表达变化,发现Sc-c-Myc、GLS1的转录水平和蛋白水平均显著上调。综上表明,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc互作促进Sc-c-Myc的表达,进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢途径,为SCRV防控提供了新的靶点。

基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法

为了建立一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)检测方法,研究基于CRISPR-Cas13a系统并结合多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)技术建立了一种MSRV的检测方法。实验对MSRV序列进行多重序列比对分析后,针对MSRV衣壳蛋白(CP)基因的特异性区域设计两个靶点,并通过体外转录成特异性的crRNA,同时设计合成MIRA引物序列实现目标序列的等温扩增,最后结合Cas13a蛋白、crRNA、恒温扩增体系构建检测体系,并从高效crRNA的选择、反应温度、ssRNA报告探针浓度和Cas13a与crRNA的浓度比四个方面优化了反应体系,并采用最优检测体系对大口黑鲈样本进行检测验证。结果显示,在20μL检测体系中加入200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2及500 nmol/L ssRNA报告探针,在37℃的情况下能够获得最佳的检测效果。并且该检测体系可以检测到102 fM的MSRV病毒,具有良好的特异性和灵敏性,此外检测结果可直接通过紫外灯照射直接观察。研究基于CRISPR/Cas13a系统结合等温扩增MIRA技术建立的MSRV检测方法,可在室温下且不需要昂贵的仪器进行MSRV病毒检测,检测结果可以肉眼直接观察,能在多种场合下使用,研究结果为检测MSRV提供了有效方法。

大口黑鲈弹状病毒Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通过优化各反应条件初步建立MSRV的Taq Man q PCR检测方法。结果显示,建立的Taq Man q PCR方法标准曲线的R2为0.9906,质粒标准品在6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(2)拷贝/μL范围内与Ct值均存在较好的线性关系。采用该方法检测MSRV及相关病毒,评估该方法的特异性,结果显示,该方法可以特异性检测MSRV,而草鱼出血病病毒、神经坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、大口黑鲈双RNA病毒、鳜蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、大口黑鲈蛙虹彩病毒等8种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;采用建立的方法检测不同浓度的质粒标准品(6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(1)拷贝/μL),评估该方法的敏感性,结果显示,该方法的检测限为6.79×10^(2)拷贝/μL,比文献中的常规PCR方法敏感1 000倍;以不同批次或同一批次提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,分别利用该方法检测,评估该方法的重复性,结果显示,该方法批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。采用该方法和文献中的常规PCR同时检测71份临床发病的大口黑鲈、鳜鱼、鲮鱼组织样品,结果显示阳性率为16.9%(12/71),阴性率为83.1%(59/71),且阳性样品均是从发病大口黑鲈的组织样品中检测到,而发病的鳜鱼、鲮鱼组织样品中均未检测到该病毒;常规PCR方法的阳性率为9.9%(7/71),阴性率为90.1%(64/71),二者的总符合率为93.0%。本研究建立的MSRV Taq Man q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于大口黑鲈临床样品的检测,为MSRV的快速检测提供了可行的技术手段。

加州鲈弹状病毒病发生原因及防控技术

伴随着加州鲈养殖规模的逐步扩大,不断暴发的各种病害成为加州鲈产业发展的制约因素之一。其中加州鲈弹状病毒病是养殖中的一种常见病毒病,其发病快、死亡率高,对加州鲈产业造成很大的损失。一、弹状病毒病发生原因通过对加州鲈近年来的发病情况分析可以发现,加州鲈弹状病毒病的发病水温一般为25~28℃。加州鲈弹状病毒病的暴发,常常与以下几个因素有直接关系。

抗大口黑鲈弹状病毒发酵中草药的筛选及其效果评价

为筛选出能够对MSRV具有抑制效果的发酵中草药,研究通过MTT法检测8种发酵中草药(L1、L2、L3、L4、L5、X1、X2和ZHS)对EPC细胞的毒性作用,结果表明L1、L2、L3、X1、X2和ZHS未对EPC细胞造成明显的损伤和毒性,L4和L5在4 mg/mL时对细胞造成损害;通过荧光定量PCR法(qRT-PCR)筛选出X1药物(主要成分为板蓝根、鱼腥草、南芪和杏仁)对MSRV有良好的抗病毒效果;在细胞水平上通过qRT-PCR法发现X1药物能够抑制MSRV的感染;空斑实验结果表明X1药物可以降低约10倍MSRV的病毒滴度。在鱼体水平上设置空白对照组、药物对照组、攻毒组、预防组和治疗组,评价X1药物对MSRV的抗病毒效果,结果表明经X1药物处理后,治疗组可以将大口黑鲈的存活率提高20%;通过qRT-PCR法检测大口黑鲈组织中病毒载量,结果表明X1药物显著抑制MSRV在肝脏、脾脏组织中的复制;通过组织病理学观察发现X1药物可以抑制MSRV引起的在肝脏、脾脏组织病变。研究为发酵中草药在水产养殖中的应用提供新的思路,为开发抗MSRV药物提供参考依据。

口服卵黄抗体对杂交鳢弹状病毒(HSHRV)感染的免疫保护效果

为了研究抗杂交鳢弹状病毒(hybrid snakehead rhabdovirus,HSHRV)卵黄抗体的制备方法并评价其免疫保护效果,将杂交鳢弹状病毒经白油乳化制备疫苗,免疫蛋鸡收集高免蛋,采用喷雾干燥方法制备成卵黄抗体粉,以细胞中和试验评估卵黄抗体中和病毒的效果。按照每kg鱼投喂卵黄抗体0.25 g、0.40 g、0.60 g的比例制备低、中、高3种添加剂量的饲料,持续投喂杂交鳢10 d,在口服免疫第4天时以104 TCID50/0.1mL的杂交鳢弹状病毒江门I株(HSHRV-JMI)病毒经腹腔注射对杂交鳢进行攻毒,并记录6 d内各组死亡情况。结果显示,四次免疫后卵黄抗体中和效价达到高峰,为1∶46.8,抗体维持时间为60d。高中低剂量组的存活率分别为64.4%、70.6%、78.5%;相对保护率分别为61.1%、67.9%、76.5%,三者均显著高于非特异性卵黄抗体对照组(P<0.001)。表明杂交鳢弹状病毒能有效刺激卵黄抗体产生,高效价卵黄抗体经口服免疫后可以有效抑制杂交鳢弹状病毒的侵染,显著提高杂交鳢存活率和相对保护率。

大口黑鲈幼鱼肝脏抗大口黑鲈弹状病毒应答的转录组分析

为探究大口黑鲈(Micropterus salmoides)对大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)的抗病反应和代谢调控网络,揭示其抗病的免疫分子机制并为后续大口黑鲈的分子生物学研究提供基础数据,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台,对MSRV感染的大口黑鲈易感组、抗病组和对照组的肝脏组织进行转录组测序分析,对所得基因的功能注释发现,被注释的差异基因主要与细胞过程、细胞、结合和催化活性等功能有关。KEGG通路富集分析结果显示,大口黑鲈肝脏组织在MSRV感染下高表达的差异基因富集在药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对外源性药物的代谢作用、蛋白酶体、抗坏血酸和醛酸盐代谢、脂肪酸降解等代谢相关通路;进一步筛选免疫相关基因进行通路分析发现,与抗MSRV免疫应答相关的通路主要为NOD样受体信号传导、C型凝集素受体信号、细胞溶质DNA传感途径、Toll样受体信号传导和RIG-I样受体信号传导等。最后,通过qRT-PCR验证了差异基因的变化趋势与转录组测序分析结果的一致性,证明了转录组数据的可靠性。获得的差异基因和调控通路可为大口黑鲈抗MSRV免疫的分子机制和疾病防控研究提供理论基础。

鳜弹状病毒糖蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入杆状病毒穿梭载体pFastBac1中转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后,筛选阳性克隆获得重组转移载体pFastBac-G,再将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑与抗性筛选后获取重组杆粒rBacmid-G,随后利用脂质体转染法将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒。将获取到的P3代重组病毒感染Sf9昆虫细胞进行重组蛋白的SDS-PAGE检测,成功表达后利用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,随后对重组蛋白进行Western blot鉴定,结果显示在大于50 ku处有一条特异性条带,而对照组无条带,表明制备的抗原能与抗体特异性结合。结果表明,鳜弹状病毒糖蛋白G在杆状病毒表达系统成功表达。本试验结果可为鳜弹状病毒糖蛋白G疫苗的研发和大规模生产提供技术支撑。

天然产物防治大口黑鲈弹状病毒病的研究概述及展望

大口黑鲈弹状病毒病是由大口黑鲈弹状病毒引起的一种高致死性病毒性疾病,对我国大口黑鲈养殖经济效益造成不良影响。自利巴韦林、盐酸吗啉胍等医用抗病毒药物被禁用后,养殖生产中可应用的抗病毒药物寥寥无几。天然产物具有生物活性广泛、多靶点、副作用低、环境友好等优点,是无公害抗弹状病毒药物创制的原材料和药源库。本文对近年来发现的中草药、植物源化合物、微生物代谢产物防治MSRV的研究进行概述,以期为抗弹状病毒药物的创新提供借鉴及参考。

大口黑鲈弹状病毒G蛋白胞外区原核表达及多克隆抗体制备

【目的】获得能特异性识别大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV)G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV双抗夹心法胶体金试纸条的研制提供材料。【方法】根据GenBank上MSRV G蛋白的基因序列(GenBank登录号:OK272491.1)设计扩增其胞外区的特异性引物,以感染MSRV的GS细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增获得目的序列,双酶切后连接至pET-28a(+)表达载体构建重组质粒pET-28a-ΔG,将重组质粒转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞。挑取测序正确的阳性克隆提取重组表达质粒pET-28a-ΔG,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,再次挑取阳性克隆,测序正确后用IPTG诱导表达。目的蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫BALB/c雌性小鼠,4次免疫后眼眶采血获得抗MSRV G蛋白的多克隆抗体,最后通过ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR结果显示,获得大小为1 323 bp的目的条带。SDS-PAGE结果显示,构建的重组表达质粒可高效表达目的蛋白,Ni柱纯化后获得单一目的蛋白,分子质量在48.5 ku左右,与预期相符,且纯度符合免疫原要求。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别不同批次的MSRV G蛋白。IFA结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别天然状态下的G蛋白。【结论】本研究利用MSRV G蛋白的胞外区重组蛋白成功制备出能特异性识别MSRV G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV的免疫检测和疫苗开发奠定了基础。

抗杂交鳢(Channa argus×C.maculate)弹状病毒卵黄抗体制备及ELISA检测方法的建立

为确定杂交鳢(Channa argus×C.maculate)弹状病毒卵黄抗体效价水平消减规律并验证抗体对病毒的中和能力,采用杂交鳢弹状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡,使用醋酸-醋酸钠-辛酸法制备卵黄抗体,建立间接ELISA检测方法以监测卵黄抗体产生过程抗体水平消减情况,以中和试验评估卵黄抗体中和杂交鳢弹状病毒效果。结果显示,ELISA检测方法最佳条件为抗原包被浓度0.5×105.8TCID_(50)/0.1 mL,37℃包被2 h,37℃封闭2 h。与大口黑鲈蛙虹彩病毒卵黄抗体、SPF蛋黄提取物、免疫前蛋黄提取物以及MBC空细胞均无交叉反应。以S/N(sample/negative)>2.1且敏感性最高为标准确定阳性、阴性样品。卵黄抗体于首免后28 d产生效价,四免后达到最高水平,效价为1︰25600,平台期可持续40~60 d,通过中和抗体检测结果证明平台期内抗体中和效价在免疫周期内最高,约为46.3。通过ELISA检测方法对卵黄抗体产生规律进行监测,通过中和检测方法评估卵黄抗体中和病毒效果。高滴度卵黄抗体具有被开发为新型抗杂交鳢弹状病毒生物制品的潜力,杂交鳢弹状病毒卵黄抗体的制备及快速检测方法的构建为该病的防治提供了理论基础和技术手段。

MiR-130c-5p靶向乌鳢水泡病毒g基因抑制病毒增殖

为了研究miR-130c-5p在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus,SHVV)感染中潜在靶基因g的靶向关系以及对病毒复制的影响,本研究以斑点叉尾鮰卵巢(channel catfish ovary,CCO)为实验材料,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术测定SHVV不同感染时间和感染剂量条件下,病毒基因水平和蛋白水平以及miR-130c-5p变化情况。此外,将SHVV的g基因上miR-130c-5p对应的靶序列克隆到质粒pmirGLO,构建质粒pmirGLO-G用于双荧光素酶报告实验进行靶基因验证。结果显示,随着SHVV感染时间及剂量的不断增加,miR-130c-5p和g基因的表达水平都显著上调。进一步实验证明,miR-130c-5p类似物和pmirGLO-G质粒共转染可显著抑制荧光素酶活性强度,而转染miR-130c-5p抑制剂则明显上调了pmirGLO-G报告载体的荧光信号。此外,miR-130c-5p的过表达显著降低了病毒g基因的mRNA及蛋白表达,而抑制miR-130c-5p的表达则上调了g基因的mRNA及蛋白的表达水平。研究结果表明,miR-130c-5p通过靶向SHVV的g基因,引起G蛋白的降解,从而抑制SHVV的增殖。本研究结果为理解microRNA调控SHVV的致病机制提供了重要基础,为抗SHVV疫苗等药物的研发提供了理论支持。

珠三角地区杂交鳢(乌鳢♂×斑鳢♀)弹状病毒感染状况调查

【目的】杂交鳢(Hybrid snakehead)为我国重要的特种水产鱼类,为摸清杂交鳢弹状病毒(Hybrid snakehead rhabdovirus,HSHRV)的感染状况,2021年3月至2022年2月对珠三角地区养殖的杂交鳢弹状病毒病展开调查。【方法】对繁育阶段的杂交鳢亲本、鱼苗、水样进行随机采样;养殖阶段则选择固定时间进行随机采样,并在病害暴发时采样。监测周期内共采集333份样品,每尾鱼经无菌解剖后,取绿豆大小肝脏、脾脏和肾脏组织混样,保存于液氮中,用于提取RNA;以反转录的cDNA为模板,采用qPCR技术进行HSHRV检测。【结果】感染HSHRV的鱼体主要临床症状为不规则游动、打转,体表无明显症状,解剖可见肝脏、脾脏、肾脏、肠道和鱼鳔充血发红或肿大;qPCR检测结果显示,333份样品的HSHRV平均阳性率为13.21%,阳性样品主要集中在4-11月,其中,8月份的样品阳性率高达23.91%;养殖阶段的HSHRV平均阳性率(17.01%)显著高于繁育阶段的平均阳性率(3.26%);从鱼体规格来看,HSHRV最易感10cm以内的鱼,阳性率高达32.20%,主要在3-9月检出;HSHRV最不易感20 cm以上的鱼,阳性率低至9.52%。【结论】明确了繁育阶段和养殖阶段以及不同养殖规格杂交鳢的HSHRV阳性率,为深入了解杂交鳢弹状病毒病的流行规律提供参考,以期为养殖过程中杂交鳢弹状病毒病的预防与控制提供数据支撑。

全面深化大中小学思政课一体化管理体制改革——以“SCRVS”模型为视角

全面深化大中小学思政课一体化管理体制改革是真正实现大中小学思想政治教育一体化的关键课题。文章以“SCRVS”模型的提出为基础,通过深入分析和构建模型,发现当前对“管理体制”问题的认识仍需深化,而构建“SCRVS”模型有助于全面剖析该体制。此模型涵盖系统结构、权变适应、资源内容、价值引领和协同机制等要素,能为管理主体提供完备的分析框架,进而揭示问题并提出相应改革举措。通过该模型,明确了“一体化建设”管理体制存在系统结构不连贯、权变适应能力不足、资源配置与共享不公平、价值引领不深入以及协同机制不完善等问题,并从缺乏整体规划、忽视权变因素、资源管理不善、价值引领重视不足以及协同机制不健全等方面探究其成因。基于此,文章提出建立健全动态优化的“一体化建设”管理体制的路径,具体包括优化系统结构、提升权变适应能力、优化资源配置、强化价值引领和完善协同机制等。

加州鲈主要病毒病诊断与防控策略(上)

加州鲈具有生长速度快、肉多刺少、味道鲜美、营养丰富、经济价值高等优点,深受广大养殖者和消费者欢迎。2022年,全国鲈鱼养殖产量达到了80万吨,主要区域集中在广东、浙江、湖北、湖南、江西、四川等地,加州鲈已成为我国主要特色淡水养殖品种之一。加州鲈适应范围广、食性杂,养殖条件下各种病原因素、环境因素和人为因素等对养殖加州鲈健康的影响显著,导致加州鲈易患多种病毒性疾病,如虹彩病毒病、弹状病毒病、神经坏死病毒病等,给加州鲈养殖带来巨大风险。以下分别介绍养殖加州鲈主要病毒病的病原、流行情况与诊断方法。

鳜鱼传染性脾肾坏死病和弹状病毒病二联灭活疫苗毒种及种子批的研究

【目的】建立鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和弹状病毒(SCRV)二联灭活疫苗毒种库及种子批。【方法】以ISKNV-QY0910株和SCRV-GM1503株为原始毒种,扩繁10代(F1~F10)后检测各代病毒对鳜鱼脑组织细胞系(CPB)的致病性及其滴度,并检测其对鳜鱼的毒力。PCR扩增ISKNV的主衣壳蛋白(MCP)基因、RT-PCR法扩增SCRV G蛋白基因序列,检测ISKNV和SCRV毒种的特异性。对F1、F5和F10代ISKNV、SCRV毒种进行细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒(RANA)和神经坏死病毒(NNV)检测,检验毒种的纯粹性。分别将F1、F5和F10代ISKNV、SCRV病毒液用甲醛灭活后制备灭活疫苗,免疫鳜鱼21 d后攻毒,连续观察14 d,待鱼体稳定后统计死亡率并计算免疫保护率(RPS)。将ISKNV和SCRV毒种湿毒保存于-80℃冰箱,每6个月取3支检测病毒滴度,以确定毒种的保存期。【结果】各代次毒株感染CPB细胞后产生的CPE形态及病变速度基本相同,SCRV滴度为10^(8.58)~10^(8.875) TCID_(50)/mL,ISKNV滴度为10^(7.38)~10^(7.625) TCID_(50)/mL。F1、F5和F10代ISKNV按10^(4) TCID_(50)/mL、SCRV按10^(6.5) TCID_(50)/mL对鳜鱼攻毒(每尾0.1 mL),致死率均超过90%。ISKNV和SCRV各代次毒种可分别扩增出1300 bp的MCP基因和1500 bp的G基因,特异性良好。ISKNV、SCRV毒种无细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒和神经坏死病毒污染。各代次病毒灭活疫苗对鳜鱼安全有效,免疫保护率ISKNV可达92%以上,SCRV可达84%以上;湿毒-80℃保存,保存期为36个月。【结论】10代以内ISKNV和SCRV的生物学特性稳定,可用于鳜鱼ISKNV和SCRV二联灭活疫苗的制备与检验。

一株鳢科鱼源弹状病毒的分离及鉴定

为研究近来鳢科鱼类疫病频发的病因,实验对采集的患病杂交鳢病料分别从细菌学和病毒学两方面进行病原分离和鉴定。排除细菌感染的可能后,通过细胞培养技术、回归感染实验、电镜技术、分子生物学技术等进行病毒学分析,最终分离到一株弹状病毒,命名为HSHRV-C1207(Hybrid Snakehead Rhabdovirus-C1207)。实验结果显示,该病毒在EPC、FHM、GSB、SFC、CIK等8种细胞中都能复制,并对其中6种细胞产生明显的细胞病变效应(CPE)。用分离的病毒进行回归感染实验,可使感染的杂交鳢复制出自然发病鱼的相同症状,且死亡率达90%。感染病料组织液的EPC细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量子弹状病毒聚集,直径约60 nm,长度约为160 nm,形态和排列方式与已报道的鱼类弹状病毒相似。参考OIE中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的检测引物及根据乌鳢弹状病毒(SHRV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、比目鱼弹状病毒(HIRRV)的G蛋白基因设计特异性引物,分别对自然发病病料组织、接种病料组织的细胞进行RT-PCR扩增,仅针对SCRV的引物能扩增出大小约350 bp的片段。对HSHRV-C1207株的G基因进行序列测定和分析,结果表明其核苷酸序列同SCRV和SHRV的同源性分别为93.8%和20.4%,推导的氨基酸序列同源性分别是93.7%和18.3%。用G基因推导氨基酸序列与其它弹状病毒的G蛋白进行系统进化树分析,表明该毒株与水泡性病毒属聚为一支,其中与SCRV的亲缘关系最近,而与属于诺拉弹状病毒属的SHRV相距甚远,可能为SCRV的变异株或一个新的毒株。

基于CPB细胞扩增体系的鳜弹状病毒增殖条件的优化

为获知鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)QY株在体外培养细胞中最适增殖条件,以鳜脑细胞系(Chinese perch brain cell line,CPB)为增殖体系,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术所测病毒拷贝数为判断指标,比较同步接毒和异步接毒2种接种方式以及病毒接种量、血清浓度等培养条件对病毒增殖的影响,确定SCRV-QY株在CPB细胞中的最适增殖条件。结果显示,单位体积病毒增殖量方面,异步接毒法优于同步接毒法,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10将病毒接种长满单层的CPB细胞中,28°C吸附1.5 h,用含2%胎牛血清的L15培养液于28°C培养时,病毒增殖量最高,为5.59×10^(10)拷贝/mL;而从单位成本所获病毒量考虑,同步接毒法筛选出的4种增殖条件单位成本所获的病毒产量优于异步接毒法,其中当MOI=0.03、胎牛血清终浓度为6%时,同步接种对数生长中期的CPB细胞,28°C恒温培养70 h后收获病毒液,单位成本所获病毒量最高,为4.88×10^(13)个拷贝/元。综上所述,本研究以病毒增殖量和培养基成本作为考量,优化SCRV-QY株的增殖条件,可为SCRV疫苗低成本、规模化生产提供理论依据。

池塘养殖斑鳢弹状病毒的分离与初步鉴定

从患暴发性死亡的斑鳢病灶中分离出一株弹状病毒。取病鱼肝、脾、肾组织过滤液接种EPC、FHM细胞,连续传至第3代后28℃培养35h出现细胞病变(CPE),测得病毒半数细胞感染量为10 5.746/0.1 mL。将病变细胞制成超薄切片,透射电镜下观察到细胞质中存在大量呈子弹状的病毒颗粒,大小约53 nm×140 nm。用上述组织过滤液及F3代细胞培养病毒液回归感染健康斑鳢均能显示与自然发病鱼相似的症状,死亡率达100%。根据鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)N蛋白保守序列设计的引物对斑鳢病毒的基因组RNA进行RT-PCR扩增,得到大小约400 bp的阳性片段。对该片段克隆、测序后与GenBank中序列进行BLAST比对,发现该基因序列与SCRV同源性最高,为94%。选取GenBank中已登录的病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鳢弹状病毒(SHRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、狂犬病毒(RV)、牙鲆弹状病毒(HIRRV)相关序列构建系统进化树,结果表明,该基因序列与SCRV聚为一支。由于该病毒粒子的形态大小与SCRV(100 nm×200 nm)存在一定差异,暂将其命名为斑鳢弹状病毒(CHRV)。