黑曲霉几丁质合成酶基因chs形态突变株的构建

以一株产柠檬酸的黑曲霉菌株为研究材料,为了优化菌株的深层发酵形态,提高柠檬酸产量,采用RNA干扰的方法,使与形态建成相关的几丁质合成酶chs基因沉默。首先将酶切得到的chs基因片段与质粒p JL43-RNAi连接,构建成干扰载体。为提高干扰载体的转化率,对原生质体制备、再生和转化条件进行了优化。然后通过聚乙二醇(PEG)介导,将构建的干扰载体导入黑曲霉的原生质体中,经过转化,筛选出形态突变株,并进行深层发酵。结果表明,在36.5℃培养16 h的幼嫩菌丝最利于原生质体释放;而5 mg/m L的溶菌酶,10 mg/m L的蜗牛酶和10 mg/m L的纤维素酶组成的混合酶系为最优的酶组合;在30℃下,以100 r/min酶解3 h可使原生质体的最大产量达到5.11×106/m L。最优的再生培养基为完全培养基,可以使再生率达到35.33%。获得的3株转化株的chs基因表达量降低,同时在深层发酵过程中,菌球的分支频率降低,分支缩短,离散菌丝减少,柠檬酸产量也分别提高12.33%,24.17%和19.61%。通过分子改造的形态突变株具有良好的产酸性能,对推动柠檬酸发酵工业的进步有重要意义。

米根霉复合诱变筛选高产L-乳酸的形态突变菌株及碳代谢流分析

以米根霉(Rhizopus oryzae) NRRL 395为出发菌株,通过紫外线与亚硝基胍(nitroso-guanidin,简称NTG)复合诱变,筛选出几株形态突变株,其L-乳酸产量较高,在此基础上,对得到的3株形态突变菌株LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3和出发菌株NRRL 395进行代谢流分析。结果表明,在发酵初期,不同菌种的碳代谢流整体变化差别并不明显,尤其是流向有机酸合成的碳源所占的比例基本相同,此时细胞更多地合成生物量以及代谢所需的蛋白,对于球状菌体,其流向生物合成所需的碳相对较多;当发酵进入后期,碳流更多地用于有机酸的合成,而此时,不同菌体形态的碳代谢流明显发生变化,均匀球状菌体更有利于碳代谢流的流动,尤其是LA-UN-1球状菌体碳代谢流更易于流向L-乳酸合成途径,而原始菌株流向L-乳酸合成途径的碳流最小。

产黄青霉形态代谢工程研究进展

丝状真菌广泛应用于工业微生物发酵,其发酵形态的多样性和调控复杂性为业界广泛关注.本文对产黄青霉的形态、调控以及与产量相关性展开研究.通过一种有效菌丝形态图像处理方法,获得菌丝形态特征参数,并应用于产黄青霉的形态动力学分析;以低能离子注入和低温空气等离子体对产黄青霉进行了复合诱变选育,比较产黄青霉形态突变株与原始菌的形态差异,揭示菌丝形态与次级代谢产物合成的相关性;以Ⅲ类几丁质合成酶基因chs4为目的基因,通过RNA干扰构建形态突变株,发现形态突变株菌丝变得粗短、分枝增多,转化株青霉素产量明显高于原始菌,其中PcRNAi1-17和PcRNAi2-1的青霉素产量分别比原始菌提高27%和41%,为产黄青霉形态代谢工程研究奠定了一定的理论基础.