骨形成蛋白2基因多态性与冠脉钙化相关性研究

目的:研究骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)基因多态性在重庆汉族人群中的分布及与冠脉钙化(coronary artery calcification,CAC)的相关性。方法:收集2019年3月至2019年5月260例重庆医科大学附属第一医院心内科重庆汉族冠脉造影患者临床资料及血液样本,通过测序检测患者BMP2 rs961253、rs235768、rs1049007,OPG rs2073617、rs2073618,S100A12 rs2916191基因位点序列,应用ELISA法检测血清BMP2、OPG、S100A12水平。结果:CAC组167例,年龄(67.13±9.64)岁;对照组93例,年龄(60.46±9.89)岁。高血压、糖尿病、肥胖患者更容易发生CAC,CAC组男性发病率、载脂蛋白A1、C反应蛋白、白细胞数以及血清BMP2、S100A12、OPG水平明显高于对照组(P<0.05)。BMP2 rs961253基因型频率及等位基因频率分布在CAC组和对照组之间有统计学差异(P<0.05)。钙化组中,BMP2 TT基因型血清BMP2水平明显高于非TT型(P<0.05)。通过校正性别、年龄、体质指数、高血压、糖尿病等影响因素后,多因素逐步logistic回归分析发现BMP2 rs961253 TT基因型人群患CAC风险较高。结论:血清BMP2水平可作为预测CAC的指标之一。BMP2 rs961253基因多态性与CAC显著相关,BMP2 rs961253 T等位基因或TT基因型是CAC的高危因素。

骨形成蛋白2活性多肽体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的剂量依赖性研究

目的探讨自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)活性多肽对大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)体外定向诱导成骨的能力,评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性。方法取4周龄Wistar大鼠分离培养MSCs,传至第3代时改用条件培养基,培养基中分别加入浓度为300、200、100、50及0μg/ml的BMP-2活性多肽,并依次记为A、B、C、D和E组。细胞培养至5、10、15及20d,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,测定钙含量,采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)检测型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA的表达,检测不同浓度BMP-2活性多肽体外诱导成骨的能力。结果倒置相差显微镜下观察,用条件培养基培养3～4d后,培养细胞由长梭形转变为短梭形或多角形。随条件培养基中BMP-2活性多肽浓度的增加,细胞发生成骨样改变的时间提前。ALP活性和钙含量检测显示,A组和B组较其他组增加明显,且差异有统计学意义(P<0.05),但A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。FQ-PCR检测发现不同浓度条件培养基培养14d后,型胶原、OPN和OCN mRNA在各组均有表达。Ct值表明其表达量的大小顺序为A、B、C、D组,E组无表达,A组和B组的Ct值明显大于C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05),但A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMP-2活性多肽能有效地促进MSCs向成骨方向分化,其诱导作用存在剂量依赖关系,最佳诱导剂量为200μg/ml。

重组人骨形成蛋白2诱导的骨膜细胞构建组织工程骨的实验研究

目的 通过组织工程技术方法 ,研究细胞 -材料复合体体内骨再生的能力。 方法 采用材料学自组装技术的原理 ,以 I型胶原蛋白为分子模板 ,引导钙磷盐在液相中的矿化 ,制备具有天然骨基质层状结构的羟基磷灰石 /胶原复合材料 ,并以热致分相法制备羟基磷灰石 /胶原 -聚乳酸 [hydroxyapatite/collagen- poly- (L- lactic acid) ,HAC-PL A]复合三维多孔框架 ,与重组人骨形成蛋白 2 (recombinant human bone morphogenetic protein2 ,rh BMP- 2 )诱导分化后的兔骨膜细胞构建组织工程骨 ,进行体外电镜及组织学观察。将 3月龄裸鼠 18只 ,分为 3组 ,每组 6只。A组皮下注射经 rh BMP- 2处理后的骨膜细胞悬液 ,B组植入未复合细胞的 HAC- PL A,C组植入 rh BMP- 2处理后的细胞 -材料复合体。术后 8周取材行组织学观察 ,C组与 B组及 A组进行比较。 结果 三维多孔 HAC- PL A框架材料孔隙率大于 90 % ,孔径为 5 0～ 30 0 μm。骨膜细胞经 5 0 0 ng/ml的 rh BMP- 2处理后 ,与改善亲水性后的 HAC- PL A三维多孔框架复合 ,构建组织工程骨。电镜显示接种的细胞能在此组织工程骨内部生长增殖 ,术后 8周 C组有新骨形成 ,A组注射部位表面平整 ,无新生物 ,B组为纤维组织 ,无骨及软骨形成。 结论 所构建的组织工程骨有望成?

骨形成蛋白2基因修饰的骨髓基质细胞与纤维蛋白复合物修复兔关节软骨缺损

目的研究骨形成蛋白2(bone mophogenetic protein 2, BMP-2)重组腺病毒(adenovirus)转染骨髓基质细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)后,与纤维蛋白凝胶构成的复合物(Ad-BMP-2+MSCs-纤维蛋白凝胶)对兔关节软骨缺损修复的影响. 方法①Ad-BMP-2转染原代培养的MSCs,通过RT-PCR、细胞免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色等观察转染后3～9 d的MSCs其BMP-2、Ⅱ型胶原及蛋白多糖转录、表达水平的变化.②转染后的MSCs种植于纤维蛋白凝胶,在体外培养1～9 d,通过上述指标及透射电镜观察三维培养条件下其软骨基质的产生.③42只日本大耳白兔先制成直径4.5 mm全层软骨缺损模型,随机分为3组(n=14):A组为Ad-BMP-2+MSCs-纤维蛋白凝胶修复组,B组为MSCs-纤维蛋白凝胶修复组,C组为空白对照组.术后4、8和12周取材行大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学及12周关节软骨弹性常数检测. 结果①Ad-BMP-2转基因MSCs的BMP-2、Ⅱ型胶原 mRNA RT-PCR检测分别在3、5 d呈阳性,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).②转基因MSCs三维培养物免疫组织化学和甲苯胺蓝染色呈阳性,电镜显示细胞生长良好,有基质合成.③A组各时间点大体、组织形态学和组织化学染色均显著优于B组和C组,12周时力学和组织学已接近正常关节软骨. 结论 Ad-BMP-2能通过促进MSCs分泌BMP-2,诱导Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达,在纤维蛋白三维支架中形成软骨基质,移植入兔关节软骨缺损区可修复直径4.5 mm缺损,其修复组织成分接近正常软骨.

骨形成蛋白2基因修饰的老年大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的观察年龄因素对骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)成骨分化能力的影响;了解基因治疗对老年大鼠MSCs成骨分化能力的影响。方法1月龄(幼年组)、9月龄(成年组)及24月龄(老年组)雄性Wistar大鼠各6只,取MSCs经体外分离、培养及携带骨形成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,BMP-2)基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2)转染后,定量检测BMP-2、碱性磷酸酶(alkalinephosphate,ALP)表达,以及成骨细胞标志性蛋白:型胶原、骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP)和骨桥素(osteopontin,OPN)的表达。将转染的各组MSCs分别与磷酸三钙(tricalciumphosphate,TCP)复合后植入裸鼠体内,3周后取材,比较各组诱导异位成骨能力。结果ELISA检测表明BMP-2基因修饰的MSCs可以有效表达BMP-2,且表达量在各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05);各组ALP于诱导后第9天达高峰,但组间差异均无统计学意义(P>0.05);诱导后第7天,RT-PCR半定量检测示各组均有成骨细胞特征性蛋白,即:型胶原、OPN及BSP的明显表达,表达量在各组间差异无统计学意义(P>0.05);BMP-2基因转染的MSCs与TCP复合后可诱导裸鼠体内异位成骨,各组成骨量差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMP-2基因修饰的老年大鼠MSCs可以恢复成骨分化能力,基因治疗可能为老年性骨骼疾病提供一种新的治疗途径。

多孔磷酸钙人工骨与重组人骨形成蛋白2复合修复骨缺损的实验研究

目的研究多孔磷酸钙人工骨(porouscalciumphosphatecement,PCPC)与重组人骨形成蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2,rhBMP-2)复合后体外的缓释作用及其对兔骨缺损的修复作用。方法采用物理吸附法将rhBMP-2(0.4mg)溶液吸附至PCPC中,制备成PCPC/rhBMP-2复合材料。冻干后,扫描电镜观察复合材料内部形态。以包覆壳聚糖的PCPC/rhBMP-2为实验组,单纯PCPC/rhBMP-2为对照组,测试在模拟体液中的rhBMP-2缓释行为。取新西兰大白兔12只,股骨远端制成直径4.2mm,深5.0mm的骨缺损模型。将包覆壳聚糖的PCPC/rhBMP-2复合材料修复骨缺损作为实验组,以植入单纯PCPC作为对照组。术后观察动物一般情况,于4周和8周取材行X线片和组织学观察。结果扫描电镜显示PCPC/rhBMP-2复合材料孔隙中吸附了大量的rhBMP-2。rhBMP-2体外缓释对照组rhBMP-2于150h基本全部释放;实验组rhBMP-2于350h缓释量约达99%,较对照组慢。动物实验动物术后切口无感染,于4周行动自如。X线片示术后4周对照组骨缺损区材料清晰,实验组骨缺损区密度大部分接近宿主骨,材料模糊;8周对照组材料边缘较术后4周模糊,实验组骨缺损区密度已基本接近宿主骨。组织学观察,术后4周对照组可见少量成骨细胞和破骨细胞,实验组可见成熟骨组织和骨髓腔,新生骨逐渐取代材料;8周对照组可见大量成骨细胞和破骨细胞,少量新生骨并向材料内长入,实验组可见成熟骨小梁和骨髓组织。结论PCPC是rhBMP-2较理想的载体材料,复合后具有良好的诱导成骨作用,可作为一种新型复合人工骨修复骨缺损,具有良好的临床应用前景。

人骨形成蛋白2基因成骨诱导作用研究

目的制备一种具有成骨活性的生物材料。方法将人BMP2-pcDNA3.1质粒添加到壳聚糖-胶原海绵支架材料中,然后将大鼠成骨细胞和成纤维细胞分别接种在该复合材料中,体外培养细胞-支架材料复合物,另外将该材料植入BALBc小鼠皮下,以添加了pcDNA3.1质粒的壳聚糖-胶原海绵支架材料为对照。10天以后,取出细胞-支架材料复合物和皮下植入物,分别检测样品的碱性磷酸酶活性和钙含量。结果与对照相比,体外培养细胞-支架材料复合物中的碱性磷酸酶活性和钙含量均显著提高;小鼠皮下植入物的碱性磷酸酶活性和钙含量也分别提高了61.5%和16.2%。结论添加了人骨形成蛋白2基因的壳聚糖-胶原海绵支架材料具有成骨诱导活性,这种材料为骨组织工程中的成骨诱导可能提供一种新的方法。

脑外伤对骨折愈合中骨形成蛋白2表达的影响

目的通过研究大鼠股骨干骨折合并脑外伤时骨痂组织内骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)表达水平的变化,探讨脑外伤对骨折愈合的影响及作用机制。方法取12周雄性SD大鼠32只,体重368±25g。随机分成4组,每组8只:A组为骨折合并脑外伤1周组,B组为单纯骨折1周组,C组为骨折合并脑外伤2周组,D组为单纯骨折2周组。A、C组制作脑外伤和股骨干骨折模型,B、D组制作单纯股骨干骨折模型作对照。各组摄X线片后截取骨痂,行HE染色观察骨痂生长情况及其组织形态,免疫组织化学染色测定BMP-2表达,RT-PCR检测BMP-2mRNA水平。结果X线片示A组骨折端有较少量骨痂形成,骨折线较清晰;B组骨折线清晰;C组骨折端有较多骨痂形成,骨折线已模糊;D组仅有少量骨痂形成,骨折线较清晰。HE染色A组可见较多早期软骨细胞、成纤维细胞;B组骨折间隙可见成纤维细胞,仅夹杂有少量的早期软骨细胞;C组骨折端有新生骨小梁长入;D组未见有骨小梁形成。免疫组织化学染色可见成纤维细胞、间充质细胞、血管内皮细胞、早期软骨细胞、成骨细胞胞浆均出现广泛的强阳性反应,A组阳性细胞数量多于B组,并且显色强;C组阳性细胞数量多于D组,并且显色强。分析显示A、C组平均阳性细胞百分数为0.762%±0.052%、0.756%±0.079%,分别高于同一时间点B、D组的0.702%±0.052%、0.672%±0.044%,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR分析显示:A～D组骨痂BMP-2mRNA含量依次递减,A、C组骨痂BMP-2mRNA含量为1.07±0.13、0.78±0.11,均显著高于同一时间点B、D组的0.91±0.12、0.61±0.08,差异有统计学意义(P<0.05)。结论脑外伤对骨折愈合有促进作用,可能与脑外伤后BMP-2表达水平升高有关。

克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体

目的探讨构建人骨形成蛋白2(humanbonemorphgeneticprotein2,hBMP-2)真核表达载体的方法。方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T-hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用EcoR和Not双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1(+)真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1(+)真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序。结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP-2扩增条带,重组质粒pGEM-T-hBMP-2经酶切电泳可见1.2kbp的hBMP-2条带和4.0kbp的载体片断;pcDNA3.1-hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与GeneBank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合。结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体。

人骨形成蛋白2噬菌粒表达载体的构建与鉴定

人骨形成蛋白２噬菌粒表达载体的构建与鉴定司晓辉杨连甲金岩陈梅红１（第四军医大学口腔医学院病理科１生化教研室，西安７１００３２）骨形成蛋白（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＢＭＰ）具有广泛的生物学作用，特别是在形态发生和细胞分化两个...

环氧化酶2、骨形态形成蛋白2和血管内皮生长因子在异位骨化组织中的表达

背景:研究发现环氧化酶2抑制剂具有预防肘关节周围异位骨化的作用。目的:观察环氧化酶2、骨形态形成蛋白2和血管内皮生长因子在肘关节创伤后异位骨化组织中的表达,并分析其相关性。方法:采用免疫组化SP法检测18例肘关节创伤后异位骨化组织及10例正常骨组织中环氧化酶2、骨形态形成蛋白2和血管内皮生长因子的表达水平,利用HPIAS-1000图像分析系统测定异位骨化组织与正常骨组织中环氧化酶2、骨形态形成蛋白2和血管内皮生长因子的平均吸光度和阳性区域面积百分率,并分析3种蛋白阳性区域面积百分率之间的相关性。结果与结论:异位骨化组织中环氧化酶2、骨形态形成蛋白2和血管内皮生长因子呈高表达;正常骨组织中呈低表达或不表达。图像分析结果显示异位骨化组织中3种蛋白平均吸光度及阳性区域面积百分率显著高于正常骨组织(P<0.01)。异位骨化组织中环氧化酶2与骨形态形成蛋白2、血管内皮生长因子的阳性区域面积百分率呈正相关(P<0.01)。提示环氧化酶2、骨形态形成蛋白2和血管内皮生长因子在异位骨化的形成过程中起重要作用,环氧化酶2可能通过诱导骨形态形成蛋白2和血管内皮生长因子的表达从而促进异位骨化组织中的成骨和血管形成。

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的骨诱导作用

目的 建立表达骨形成蛋白 2 (BMP_2 )的人牙周膜成纤维细胞 (HPDLFs) ,观察其体内成骨作用 ,为牙周缺损修复基因疗法的建立提供实验依据。方法 采用脂质体载体将人BMP_2噬菌粒表达载体pBK_B2转染至HPDLFs。利用免疫组化ABC法检测转染细胞内BMP_2蛋白的表达 ,并于无菌条件下将转染细胞注射于裸鼠股部肌肉内 ,2 1d后取材 ,苏木精—伊红染色观察肌肉组织内骨形成情况。结果 BMP_2基因转染后HPDLFs内有BMP_2蛋白的表达。在注射BMP_2基因转染细胞的肌肉组织内可见明显的新骨形成。结论 BMP_2基因成功转入HP DLFs中并得到有效表达 。

重组人骨形成蛋白2与骨诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的观察重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein2,rhBMP-2)与骨诱导剂对SD大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖与成骨作用。方法体外培养大鼠MSCs,分为实验组与对照组。对照组:不加rhBMP-2与骨诱导剂。实验组:骨诱导剂单独作用于SD大鼠MSCs(A组);rhBMP-2分别以浓度为10(B组)、50(C组)、100(D组)、200μg/L(E组)单独作用于SD大鼠MSCs;rhBMP-2分别以浓度为10(F组)、50(G组)、100(H组)、200μg/L(I组)联合骨诱导剂作用于SD大鼠MSCs。测定第3、6、9、12天的增殖状况(MTT法)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和骨钙素(osteocalcin,OC)水平。结果倒置相差显微镜观察SD大鼠MSCs原代培养时,细胞接种12h后即可贴壁;48h细胞成梭形,形似成纤维细胞;4d时细胞为多角形、纺锤形;6d时,成纤维细胞散在分布,少量呈集落样生长,为漩涡状、放射状排列;10d左右,细胞基本铺满瓶底,融合成片。传代细胞5~7d即可长满瓶底。各时间点A^I组均能显著促进MSCs成骨活性(ALP和OC)的表达。B^E组同时具有促进MSCs增殖作用,并呈浓度依赖性;F^I组增殖及ALP、OC含量均高于A^E组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论rhBMP-2与骨诱导剂联合作用可在促进MSCs增殖的同时提高其成骨活性。

骨形成蛋白2基因修复兔桡骨缺损的实验研究

目的观察携带人骨形成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,BMP-2)基因的腺病毒载体(adenoviruscarryingBMP-2gene,Ad-BMP-2),通过纤维蛋白凝胶与牛松质骨支架(bovinecancellousbone,BCB)复合,修复骨缺损的效果。方法将60只新西兰大耳白兔随机分为4组,每组15只。制成双侧桡骨中段1.5cm骨缺损模型,采用4种材料植入修复。A组Ad-BMP-2+BCB;B组重组BMP-2+BCB;C组携带β-半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体(adenoviruscarryingβ-galgene,Ad-Lacz)+BCB;D组单纯BCB支架。修复术后各组于4、8和12周各处死动物5只取材,行X线片、组织学、生物力学和免疫组织化学染色检查。结果A、B两组骨缺损均得到了修复,但术后各时间点,A组在成骨活跃程度、新生骨量、力学强度及BMP-2表达等方面均明显优于B组;C、D两组均无新骨形成。结论BMP-2直接基因治疗,操作简便、骨诱导能力强,是修复节段性骨缺损的有效方法。

胶原基纳米骨复合重组人骨形成蛋白2及钛膜修复即刻钛种植体周围骨缺损(英文)

背景:影响即刻种植术成功的主要因素是种植体大小、形状往往与拔牙创不相适合,不能形成种植体与拔牙创的紧密接触,解决这一影响因素的方法多采用诱导骨再生膜技术或应用植骨材料。目的:观察胶原基纳米骨(nano-hydroxyapatite/collogen,nHAC)复合重组人骨形成蛋白2(recombinant human bonemorphogenetic protein-2,rhBMP-2)及钛膜修复即刻钛种植体周围骨缺损的效果。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-01/2006-01在解放军第四军医大学中心实验室完成。材料:宝鸡有色金属研究院提供的纯钛材料制成直径2mm,长10mm,螺距0.4mm,带自攻式螺纹的钉状螺旋种植体,无穿龈部分。西安中邦钛生物材料有限公司生产的不可吸收医用钛膜,大小为2cm×2cm。胶原基纳米骨由清华大学崔福斋教授惠赠,加工成0.5mm×0.5mm×0.5mm的立方体。rhBMP-2由北京军事医学科学院提供。将rhBMP-2用盐酸胍溶解,将制备好的胶原基纳米骨浸入其中,抽真空,冻干,每粒胶原基纳米骨约复合1mgrhBMP-2。方法:选用健康雄性Beagle纯种犬4只,钛种植体周围骨缺损的修复方法分为以下6组:①阳性对照组植入自体牙槽松质骨。②空白对照组缺损区不植入任何物质,只覆盖钛膜。③nHAC组仅植入nHAC。④nHAC+钛膜组植入nHAC,表面覆盖钛膜。⑤nHAC+rhBMP-2组植入nHAC复合rhBMP-2材料。⑥nHAC+rhBMP-2+钛膜组植入nHAC复合rhBMP-2材料,表面覆盖钛膜。每只动物的每侧下颌骨各形成6个缺损区,将6组材料随机植入。主要观察指标:术后6,12周,采用X射线摄片、骨密度测量及组织学检查,观察新骨形成情况和新骨与种植体的关系。结果:12周时各组骨缺损区均愈合良好,骨创均由新生骨所充满,种植体稳固,骨整合良好。nHAC+rhBMP-2组及nHAC+rhBMP-2+钛膜组成骨较早,骨成熟较早。nHAC+钛膜组、空白对照组、nHAC+rhBMP-2+钛膜组,钛膜下骨生成较好,牙槽嵴较丰满。nHAC+rhBMP-2+钛膜组不但成骨较早,骨形成量最多,而且牙槽嵴最为丰满,12周时骨密度已与阳性对照组一致,但较自体骨移植牙槽嵴更丰满,成骨量更多。空白对照组成骨最慢,阳性对照组成骨最快,但牙槽嵴顶稍有吸收。结论:nHAC具有良好的骨引导作用,修复种植体周骨缺损较好,复合rhBMP-2或/和钛膜后效果更佳。临床上可根据具体情况选用修复即刻种植体周围骨缺损的方法。

壳聚糖与重组人骨形成蛋白2复合物体外成骨作用的研究

目的探讨复合重组人骨形成蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2,rhBMP-2)的壳聚糖-明胶支架的体外成骨作用。方法将rhBMP-2与壳聚糖-明胶支架复合,按2×104/ml的密度接种成骨细胞系或成肌细胞系至rhBMP-2复合材料上,以及无rhBMP-2复合的对照材料上。A组(2T3成骨细胞接种组),其中实验A组复合有rhBMP-2的材料14块,分别于接种培养第3、7、14和21天各取3块,以管家基因β-tubulin为内参照,RT-PCR行半定量分析,测定骨钙素基因表达水平,余2块于第14天终止培养,茜素红-S染色观察钙盐沉积情况;对照A组未复合rhBMP-2的材料5块,接种培养至14d终止,其中3块用于测定骨钙素基因表达,2块测定钙盐沉积。B组(C2C12成肌细胞接种组),实验组及对照组情况、培养时间及检测指标同A组。另取接种有rhBMP-2的材料2块接种2T3成骨细胞,培养3d后扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况。结果A组培养3d,扫描电镜可见成骨细胞紧密黏附于多孔材料网表面,生长状态良好。实验A组成骨细胞中骨钙素基因的表达为1.28±0.17,对照A组14d为0.56±0.09,表明复合rhBMP-2可促进材料中骨钙素基因表达,两者差异有统计学意义(P<0.01);rhBMP-2还可诱导不表达骨钙素基因的C2C12成肌细胞出现基因表达,B组培养21d,实验B组为0.58±0.13,对照B组为0,差异有统计学意义(P<0.01)。茜素红-S染色可见,A组材料网络内均有不同程度的钙盐沉积。接种相同的细胞时,复合有rhBMP-2的材料中有更多的钙盐沉积。结论复合有rhBMP-2的壳聚糖-明胶人工骨支架材料在体外具有良好的诱导成骨能力。

重组人骨形成蛋白2基因在大肠杆菌中的克隆

目的 :在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白 2基因。方法 :由人成骨细胞中提取细胞总RNA ,利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白 2基因cDNA ;将获得基因片段重组到pCI质粒中 ,转化到大肠杆菌Top10后挑选克隆 ,利用限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定重组质粒。结果 :质粒DNA酶切分析及核酸序列分析证实 ,获得的基因片段为人BMP2全编码序列。结论 :克隆获得人骨形成蛋白 2基因 ,为表达骨形成蛋白 2奠定了基础。

转化生长因子β及重组人骨形成蛋白2对雪旺细胞生物学行为影响的实验研究

目的研究转化生长因子β(transformin ggrowth factorβ,TGF-β)、重组人骨形成蛋白2(recom binant humanbonemor phogenetic protein2,rhBMP-2)对雪旺细胞生物学行为的影响。方法体外培养SD乳鼠雪旺细胞,按5×103/孔接种96孔板,分为3组。A组:加入50ng/mlTGF-β;B组:加入50ng/mlrhBMP-2;C组不作任何处理,作为空白对照组。采用MTT法每天取4孔连测9d细胞数,并绘制生长曲线;流式细胞仪测定细胞周期以观察雪旺细胞增殖情况;ELISA双夹心法测定培养液中神经生长因子(nervegrowth factor,NGF)含量。结果MTT法检测显示A、B组细胞生长曲线远离C组,逐渐上升到第8、9天差异明显,A组较B组上升趋势更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪测定显示A组和B组细胞增殖指数较C组高(P<0.05)。ELISA法检测A组上清NGF含量最高,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论外源性TGF-β、rhBMP-2均能促进雪旺细胞增殖和分泌NGF的功能,而TGF-β更优于rhBMP-2。

腭中缝牵张成骨中骨形成蛋白2的表达

背景:正畸医生常常通过扩大腭中缝矫正上颌骨横向发育不足。骨形成蛋白2可以诱导骨和软骨的形成,促进牵张成骨过程中的骨重建。然而关于骨形成蛋白2在腭中缝牵张成骨中的时间空间表达规律尚不清楚。目的:观察骨形成蛋白2在大鼠腭中缝牵张成骨过程中的表达规律。方法:实验选用80只5周龄雄性Wistar大鼠,分为实验组和对照组(包括阴性对照和空白对照)。将初始力值为50g的腭中缝扩大簧黏接到大鼠两侧上颌牙列上建立大鼠腭中缝牵张模型,牵张1,4,7,14d后,采用免疫组织化学和实时定量荧光PCR方法分析骨形成蛋白2蛋白和mRNA在各加力时间点的表达。结果与结论:腭中缝扩张后骨形成蛋白2蛋白表达水平显著增加,且存在时空表达差异,主要定位于腭中缝纤维组织、软骨细胞层、骨细胞和成骨细胞胞浆及其细胞外基质。同时,骨形成蛋白2 mRNA表达也明显上调。提示腭中缝牵张力可刺激骨缝中骨形成蛋白2蛋白和mRNA的合成,在骨缝塑建过程中发挥重要作用。

大鼠胚胎胸椎发育中转化生长因子β1、骨形成蛋白2和Smad4的表达及意义

目的：探讨转化生长因子β1（TGF-β1）、骨形成蛋白2（BMP-2）和Smad4蛋白在大鼠胚胎发育不同时期胸椎的表达情况及意义。方法：用免疫组织化学SABC法与RT-PCR法检测第11-19日在大鼠胚胎胸椎TGF-β1、BMP-2和Smad4表达情况。结果：TGF-β1、BMP-2和Smad4在大鼠不同发育时期胸椎表达部位的变化情况较一致,在E11-E16的脊索细胞及随后的髓核细胞一直呈阳性表达,在E11、E12的生骨节细胞不表达或表达很少;在E13-E19的成软骨细胞及软骨细胞的表达随胚龄的增加而增多;在E14-E19的软骨膜有阳性表达,在骨膜细胞有微弱表达;在软骨基质及围索管始终呈阴性表达。其中TGF-β1和BMP-2在E11-E13.5的细胞外基质有阳性表达,而Smad4无表达。TGF-β1的表达丰度相对恒定;BMP-2与Smad4的表达丰度各有不同程度的变化。结论：TGF-β1、BMP-2和Smad4可能与其他细胞外基质分子共同调节生骨节细胞的迁移、黏附以及围索管和软骨基质的产生有关,促进软骨细胞增殖、分化、成熟与凋亡,并进一步诱导软骨细胞的骨化。