循环外泌体miR-485-3p和miR-32-5p表达与早发冠心病发病的相关性研究

目的分析循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p表达和早发冠心病发病的相关性。方法回顾性纳入2023年10月至2024年5月确诊为早发冠心病的50例患者作为观察组,另外纳入同期检查排除冠心病诊断的50例健康体检者作为对照组,收集两组基本资料和临床资料,对存在差异的指标采取多元logistic回归模型分析早发冠心病的影响因素,采取Spearman相关分析法分析血浆外泌体miR-485-3p、miR-32-5p水平和早发冠心病发生及Gensini积分的相关性,并绘制受试者工作特征(ROC)曲线,评价血浆外泌体miR-485-3p、miR-32-5p单独或联合对早发冠心病的预测价值。结果观察组的冠心病家族史比例、吸烟史比例、低密度脂蛋白(LDL)、miR-485-3p、miR-32-5p及Gensini积分均高于对照组(P<0.05)。存在差异的指标采取多元logistic回归模型分析,发现吸烟史、冠心病家族史、LDL、miR-485-3p、miR-32-5p均为影响早发冠心病发生的主要因素,OR值分别为6.997(95%CI:1.578~31.027)、16.671(95%CI:1.666~166.799)、2.632(95%CI:1.060~6.537)、12.717(95%CI:2.629~61.505)、6.000(95%CI:1.839~19.571)。早发冠心病和循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p表达呈正相关关系(r=0.525、0.548,P<0.05);早发冠心病Gensini积分和循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p表达也呈正相关关系(r=0.485、0.506,P<0.05)。ROC曲线发现,循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p预测早发冠心病的ROC曲线下面积(AUC)值分别为0.927、0.936,联合预测的AUC值达到0.957。结论循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p在早发冠心病中表达均上调,二者与早发冠心病发病及冠脉病变程度呈正相关,均为疾病发生的影响因素,能当作预测疾病发生的潜在生物标志物,且联合两项指标的预测价值更高。

清肾颗粒通过调控外泌体、miR-330-3p以及CREBBP表达抑制小鼠肾纤维化

目的探讨清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型及尿酸刺激下NRK-49F细胞的作用及其调控外泌体、miR-330-3p和CREBBP的机制。方法动物实验:构建腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型,分为正常组、模型组和清肾颗粒组(8.0 g·kg^(-1)·d^(-1)),6只/组,灌胃12周。采用尾静脉注射腺相关病毒载体,实验结束后收集双侧肾组织。观察小鼠肾组织外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测小鼠肾组织Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;HE和Masson染色观察小鼠肾组织病理学变化。细胞实验:构建尿酸刺激下的NRK-49F细胞模型(尿酸400μmol/L),SD大鼠灌胃制备清肾颗粒含药血清用于细胞实验,分为正常组、模型组和清肾颗粒含药血清组。观察NRK-49F细胞中外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测NRK-49F细胞中Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;双荧光素酶报告基因检测miR-330-3p与CREBBP靶向关系;RT-qPCR和Western blotting检测NRK-49F细胞中miR-330-3p与CREBBP表达变化。结果动物实验中,Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平降低(P<0.05)。Western blotting及免疫荧光结果显示,与正常组相比,模型组Col-III、α-SMA、FN表达增加,E-cad表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组Col-III、α-SMA、FN表达减少,E-cad表达增加(P<0.05)。肾脏病理检查显示,清肾颗粒可以明显减轻小鼠肾组织纤维化(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,尾静脉注射腺相关病毒病毒载体抑制miR-330-3p表达,增加CREBBP水平,减轻肾纤维化(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,CREBBP是miR-330-3p的靶点(P<0.05)。RT-qPCR和Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组miR-330-3p表达增加,CREBBP表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组miR-330-3p表达减少,CREBBP表达增加(P<0.05)。细胞实验结果与动物实验结果趋势一致。结论清肾颗粒通过干预外泌体,降低miR-330-3p水平,增加CREBBP表达抑制肾纤维化。

COPD患者肺泡灌洗液来源外泌体通过miR-223-3p/FOXO3通路抑制成骨细胞成骨分化的作用

目的探索慢性阻塞性肺病患者肺泡灌洗液来源的外泌体(COPD-bronchoalveolar lavage fluid-exosome,COPD-Exo)调控成骨细胞分化的作用及机制。方法选取2023年6月于陆军军医大学第一附属医院就诊的6例COPD患者和6例非COPD患者(对照),在临床肺泡灌洗过程中收集肺泡灌洗液,提取COPD-Exo、非COPD患者肺泡灌洗液来源的外泌体(ctrl-bronchoalveolar lavage fluid-exosome,Ctrl-Exo),使用电镜和Western blot进行鉴定。使用茜素红染色、qRT-PCR检测COPD-Exo干预成骨细胞后成骨分化水平的改变。对GEO数据库数据集(GSE218571)中COPD-Exo的微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱进行生物信息学分析,获得COPD-Exo中差异表达的miRNA,使用Antagomir阻碍MircoRNA功能,明确具有成骨分化调控功能的miRNA,使用Targetscan软件预测miRNA的下游靶基因并进行验证。结果COPD患者和非COPD患者的肺泡灌洗液内均可提取出外泌体。茜素红染色及PCR结果表明,COPD-Exo可以抑制人hFOB 1.19成骨细胞的成骨分化(P<0.05)。生物信息学分析显示,COPD-Exo中miR-223-3p表达水平显著上调。使用Antagomir阻碍miR-223-3p可减轻COPD-Exo对于人hFOB 1.19成骨细胞的成骨分化抑制(P<0.05)。Targetscan预测和Western blot结果显示miR-223-3p可能靶向抑制成骨分化相关因子FOXO3的表达(P<0.05)。结论COPD-Exo可能通过miR-223-3p抑制人hFOB 1.19成骨细胞的成骨分化,该过程与miR-223-3p抑制FOXO3表达有关。

幽门螺杆菌诱导的胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p通过靶向PTEN抑制巨噬细胞自噬并促进其M2极化

目的:探讨幽门螺杆菌(H.pylori)诱导的人胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响及机制,为进一步阐明H.pylori的致癌机制提供新线索。方法:超高速离心法和试剂盒提取H.pylori刺激组和对照组AGS细胞释放的外泌体,采用透射电镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)和Western blot对外泌体进行鉴定;qRT-PCR检测H.pylori诱导的胃癌细胞AGS源性外泌体中miR-382-5p表达;将miR-382-5p mimic转染至THP-1巨噬细胞,Western blot检测巨噬细胞自噬标志物LC3Ⅱ、P62、Beclin-1的表达,免疫荧光检测自噬小体数量;Western blot检测PTEN蛋白、其下游蛋白PI3K、AKT、mTOR及其磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平;流式细胞术检测巨噬细胞表型分子CD206和HLA-DR表达水平;ELISA检测巨噬细胞上清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和精氨酸酶1表达水平。结果:提取的外泌体符合外泌体形态,且高表达其表面标志蛋白CD9、CD63、TSG101;与空白对照组相比,H.pylori感染组AGS源性外泌体中miR-382-5p表达显著升高;miR-382-5p mimic转染导致巨噬细胞LC3、Beclin-1表达降低,P62表达升高,自噬小体数量降低;PTEN蛋白表达降低,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达明显增加。转染同时导致巨噬细胞M2型标志蛋白CD206表达增加,M1型标志蛋白HLA-DR表达降低;IL-10和精氨酸酶1表达增加,IL-6和TNF-α表达降低。抑制剂BEZ235预处理可部分逆转miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响。结论:H.pylori诱导的胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p通过靶向PTEN基因,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制巨噬细胞自噬并促进其M2极化。

胸腔积液外泌体miR-506-3p联合腺苷脱氨酶检测在结核性胸膜炎的早期诊断及预后评估中的价值

目的 分析胸腔积液外泌体miR-506-3p联合腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)在结核性胸膜炎的早期诊断及预后评估中的价值。方法 选取2021年8月至2023年3月就诊于沧州市人民医院的90例结核性胸膜炎患者作为结核组,另选同期于沧州市人民医院就诊的50例非结核性胸膜炎(肺炎旁胸腔积液、恶性胸腔积液等)患者作为非结核组,对比两组临床资料与胸腔积液外泌体miR-506-3p、ADA水平,经多因素Logistic回归分析影响结核性胸膜炎发生的危险因素。根据治疗3个月后患者预后情况,将结核组分为预后良好组(72例)、预后不良组(18例),对比两组胸腔积液外泌体miR-506-3p、ADA水平。经Pearson相关性分析,并绘制受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线),分析胸腔积液外泌体miR-506-3p、ADA水平及二者联合预测结核性胸膜炎发生及患者预后的价值。结果 结核组患者胸腔积液ADA水平比非结核组高,胸腔积液外泌体miR-506-3p水平比非结核组低(P<0.05);经多因素Logistic回归分析发现,胸腔积液ADA水平高[OR=1.205(95%CI 1.105~1.313)]是结核性胸膜炎发生的危险因素(P<0.05),外泌体miR-506-3p水平高表达[OR=0.320(95%CI 0.158~0.658)]是结核性胸膜炎发生的保护因素(P<0.05);预后不良组患者胸腔积液ADA水平比预后良好组高,胸腔积液外泌体miR-506-3p水平比预后良好组低(P<0.05);绘制ROC曲线发现,胸腔积液ADA、外泌体miR-506-3p水平及二者联合预测结核性胸膜炎发生的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.729(95%CI 0.640~0.818)、0.810(95%CI 0.738~0.883)、0.874(95%CI 0.818~0.930),预测结核性胸膜炎患者不良预后的AUC为0.892(95%CI 0.806~0.978)、0.924(95%CI 0.868~0.981)、0.942(95%CI 0.875~1.000);Pearson相关性显示,胸腔积液ADA与外泌体miR-506-3p水平呈负相关(r=-0.335,P=0.001)。结论 结核性胸膜炎患者胸腔积液外泌体miR-506-3p呈低表达、ADA呈高表达,二者之间为负相关,且miR-506-3p联合ADA可有效预测结核性胸膜炎患者不良预后的发生。

胃癌外泌体来源的miR-151-3p诱导巨噬细胞M2型极化并促进肿瘤生长

目的 探索胃癌细胞来源的外泌体是否可以通过微小RNA-151-3p(miR-151-3p)来影响肿瘤微环境中的巨噬细胞极化。方法 采用实时定量PCR检测胃癌患者癌组织和正常组织miR-151-3p的表达,实时定量PCR检测手术后胃液中miR-151-3p水平;构建过表达miR-151-3p的胃癌细胞系,分离外泌体并进行鉴定;流式细胞术检测与携带miR-151-3p的外泌体共孵育的RAW264.7细胞上CD11b和CD163的表达;在裸鼠移植瘤模型中评价携带miR-151-3p的外泌体对肿瘤生长的影响及对肿瘤相关巨噬细胞CD86和CD163的影响。结果 与正常组织相比,胃癌患者癌组织miR-151-3p高表达,且多数患者手术后的胃液中miR-151-3p的含量较术前有所降低;所分离的过表达miR-151-3p的肿瘤细胞外泌体中miR-151-3p的含量也较未转染细胞显著升高;携带miR-151-3p的外泌体与RAW264.7细胞共孵育可以诱导其向M2型极化,同样的,裸鼠皮下移植瘤实验也显示携带miR-151-3p的外泌体可以诱导肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化,并促进肿瘤生长。结论 胃癌外泌体来源的miR-151-3p可以诱导巨噬细胞M2型极化,促进胃癌的生长。

人脐间充质干细胞外泌体通过miR-126-3p抑制前列腺癌生长的相关研究

目的探究人脐间充质干细胞外泌体(hucMSCs exo)miR-126-3p对前列腺癌生长的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测RWPE.1､LNCaP､PC-3､C4-2中miR-126-3p表达水平。C4-2细胞中转染miR-126-3p mimic､inhibitor､negative control后检测细胞的增殖水平。提取并鉴定hucMSCs exo,将hucMSCs exo与C4-2细胞共孵育后检测C4-2细胞中miR-126-3p表达水平和细胞的增殖能力,并且将hucMSCs转染miR-126-3p mimic､inhibitor､negative control后提取外泌体,将外泌体与C4-2共孵育后检测miR-126-3p表达水平及细胞的增殖能力。结果miR-126-3p低表达于LNCaP､PC-3､C4-2细胞。miR-126-3p mimic可显著抑制C4-2细胞的增殖能力。与hucMSCs exo共孵育后C4-2 miR-126-3p表达水平显著上调,细胞增殖能力下降,hucMSCs exo可传递miR-126-3p至C4-2细胞,并且外泌体miR-126-3p可显著抑制C4-2细胞的增殖能力。结论hucMSCs exo可通过递送miR-126-3p而抑制前列腺癌细胞的生长。

被α-synuclein激活的小胶质细胞通过外泌体转运miR-19a-3p抑制神经细胞自噬

【目的】研究被过表达α-synuclein的SH-SY5Y细胞外泌体刺激后的小胶质细胞重新分泌的外泌体(SNCA-HM Exo)的miRNAs成分变化,及其对神经细胞自噬的影响。【方法】收集小胶质细胞外泌体进行miRNAs芯片分析和PCR检测,筛选出差异表达的miRNAs,对其靶基因进行KEGG及GO分析,筛选出与PI3K/Akt/信号通路相关的miRNAs。将SH-SY5Y细胞分为四组,分别为Con-HM Exo组,Con-HM Exo+miR-19a mimic组,SNCA-HM Exo组以及SNCA-HM Exo+miR-19a-3p inhibitor组,采用Western Blot进行验证试验。【结果】芯片分析和PCR共筛选出15个差异表达的miRNAs。KEGG及GO分析发现,其靶基因富集分值最高的是PI3K/Akt信号通路,其中miR-19a-3p调控PI3K/Akt信号通路的靶基因包括PTEN等。验证试验发现,miR-19a模拟物组及SNCA-HM Exo组与对照组比较PTEN、LC3Ⅱ/Ⅰ下降,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、P62升高(P<0.05),而miR-19a抑制剂可逆转这一作用(P<0.05)。【结论】SNCA-HM Exo可通过miR-19a-3p调控PTEN,激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而抑制神经细胞自噬。

血清外泌体MIR210HG、miR-337-3p在子宫内膜癌中的表达及意义

目的探究血清外泌体MIR210HG、miR-337-3p在子宫内膜癌(EC)中的表达水平及临床意义。方法选取收治的95例EC患者为研究对象,即为EC组,正常健康体检者85例为对照组,采用qRT-PCR法检测MIR210HG、miR-337-3p的表达水平;用Pearson相关性分析血清外泌体MIR210HG、miR-337-3p表达水平相关性;ROC曲线分析血清外泌体MIR210HG、miR-337-3p对EC的诊断价值;多因素logistic回归分析影响EC发生的危险因素。结果EC组血清外泌体MIR210HG的表达水平高于对照组,miR-337-3p表达水平低于对照组,二者具有负相关关系(r=-0.336,P<0.05);MIR210HG和miR-337-3p表达水平与组织学分级、淋巴结是否转移、肌层浸润、肿瘤分化有关(P<0.05)。MIR210HG、miR-337-3p联合诊断EC的ROC曲线下面积(AUC)高于二者单独诊断的AUC(P<0.05);Logistic回归分析显示,组织学分级、淋巴结转移、肿瘤分化、MIR210HG、miR-337-3p表达为EC发生的影响因素(P<0.05)。结论EC患者血清外泌体中MIR210HG表达水平显著增加,而miR-337-3p表达水平显著降低,二者表达呈负相关,且与EC的发生密切相关。

过表达GATA-4骨髓间充质干细胞外泌体中miR-330-3p的时-量变化

背景:前期实验已经证明过表达GATA-4骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌体(exosomes)可以通过抑制心肌细胞凋亡,有效修复心肌梗死引起的心肌损伤,进一步发现在其外泌体中miRNA-330-3p明显高表达且功能涉及抗凋亡,提示miRNA-330-3p可能是外泌体修复心肌损伤的关键分子。目的:探讨过表达GATA-4小鼠BMSCs分泌的外泌体(BMSCs^GATA-4-exosomes)中miR-330-3p的时-量变化。方法:在过表达GATA-4小鼠BMSCs培养体系内加入miR-330-3p模拟剂(miR-330-3p-mimic)及抑制剂(miR-330-3p-inhibitor)作为BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-mimic组及BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor组,将BMSCs^GATA-4组、BMSCs^GATA-4-空载体组、BMSCs组、BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-mimic-空载体组及BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor-空载体组作为混杂因素对照组。上述各组与基因开启剂强力霉素共培养24,48h,提取各组细胞分泌的外泌体。采用RT-PCR检测各组细胞及其外泌体内miR-330-3p的表达量。采用光镜评估BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-mimic组、BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor组与BMSCs组细胞在24,48h的形态变化。结果与结论:①BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-mimic,组细胞与外泌体内miR-330-3p的表达率最高,且随着时间推移其miR-330-3p的表达逐渐增多;②BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor组细胞与外泌体内miR-330-3p的表达率最低,且随着时间推移其miR-330-3p的表达逐渐减少;③BMSCsz^GATA-4-miR-330-3p-mimic组、BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor组与BMSCs组在24,48h的形态无变化;④结果表明,BMSCs内miR-330-3p表达与外泌体内miR-330-3p表达正相关,BMSCs过表达miR-330-3p可以有效提高外泌体中miR-330-3p的表达,而静默miR-330-3p可以有效减少外泌体中miR-330-3p的表达。

脂肪间充质干细胞外泌体miR-212-3p对成纤维样滑膜细胞的影响

目的探讨脂肪间充质干细胞(ADSCs)外泌体miR-212-3p对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞RA-FLS增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法收集海南医学院第一附属医院类风湿性关节炎(RA)患者和健康者血清各20例,采用RT-qPCR检测血清中miR-212-3p的表达情况。体外细胞可分为4组:RA-FLS细胞单独培养(NC组)、RA-FLS细胞+Exo-ADSCs共培养(Exo组)、RA-FLS细胞+沉默外泌体miR-212-3p共培养(Exo-antagomiR-212-3p组)、敲降RA-FLS细胞SMAD1+沉默外泌体miR-212-3p共培养(si-SMAD1+Exo-antagomiR-212-3p组)。外源性调节ADSCs细胞中miR-212-3p和RA-FLS细胞中SMAD1的表达水平后,将ADSCs外泌体与RA-FLS细胞共培养,CCK-8和Transwell分别检测RA-FLS细胞增殖活力、迁移和侵袭能力;采用双荧光素酶报告基因验证miR-212-3p与SMAD1之间的靶向关系。结果与健康者相比,miR-212-3p在RA患者血清中低表达,差异有统计学意义(P<0.05);与NC组相比,Exo组中miR-212-3p表达显著上调,增殖活力、迁移和侵袭显著降低,差异无统计学意义(均P>0.05);miR-212-3p能够靶向结合SMAD1的3′UTR;同时与NC组相比,Exo组及si-SMAD1+Exo-antagomiR-212-3p组中SMAD1相对表达、RA-FLS细胞增殖活力、迁移和侵袭数显著降低,差异无统计学意义(均P<0.05),而Exo-antagomiR-212-3p组中SMAD1相对表达、RA-FLS细胞增殖活力、迁移和侵袭数与NC组比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。结论ADSCs外泌体miR-212-3p在RA患者和RA-FLS细胞中低表达,其通过靶向下调SMAD1抑制RA-FLS细胞增殖、迁移和侵袭。

骨髓间充质干细胞外泌体miR-126-3p靶向CCR1抑制非小细胞肺癌细胞恶性增殖及转移

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)来源的外泌体中miR-126-3p靶向趋化因子受体1(chemokine receptor 1,CCR1)对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法培养BMSCs,提取外泌体并通过外泌体标志蛋白CD63和TSG101进行鉴定;外泌体共培养A549细胞不同时长(0、24、48、72 h)后,CCK-8检测细胞存活率,q RT-PCR检测miR-126-3p和CCR1 m RNA表达,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;Western blotting检测CCR1、上皮钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、神经钙黏蛋白(N-cadherin,N-cad)和波形蛋白(Vimentin)相对表达。结果外泌体呈边缘高亮、中间灰暗的圆形或椭圆形杯状结构,粒径分布范围152 nm左右,有CD63、TSG101蛋白表达;外泌体中miR-126-3p表达高于A549细胞,A549细胞中CCR1 m RNA表达高于外泌体,而在A549细胞与外泌体共培养后,A549细胞中miR-126-3p表达升高,CCR1表达降低;A549细胞与外泌体共培养0、24、48、72 h,细胞的存活率、迁移和侵袭能力和CCR1、N-cad和Vimentin蛋白表达及CCR1 m RNA表达均随着培养时间的延长逐渐降低,而miR-126-3p水平和E-cad蛋白表达随着培养时间的延长逐渐升高。结论BMSCs来源的外泌体与A549细胞共培养可提高细胞中miR-126-3p的表达,miR-126-3p通过靶向抑制CCR1表达可降低A549细胞增殖、迁移和侵袭能力。

外泌体携带的miR-142-3p通过靶向COX-2抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭

目的:探讨骨肉瘤组织中miR-142-3p是否可以通过靶向COX-2来抑制肿瘤细胞增殖和侵袭能力,并且验证携带miR-142-3p的外泌体是否可以抑制骨肉瘤细胞生长。方法:检测骨肉瘤癌组织及癌旁组织中miR-142-3p和COX-2 mRNA的表达。用双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-3p与COX-23'UTR的靶向关系。构建过表达miR-142-3p及COX-2细胞系,检测细胞的增殖及侵袭能力。用携带miR-142-3p的外泌体处理肿瘤细胞,检测细胞的增殖及侵袭能力。对携带miR-142-3p的外泌体进行体内抑瘤实验。结果:较癌旁组织而言,miR-142-3p在癌组织中显著低表达(P<0.05),而COX-2在癌组织中显著高表达(P<0.05),且COX-2是miR-142-3p的靶标。过表达miR-142-3p的细胞增殖及侵袭能力降低(P<0.001)。体外增殖实验及小鼠体内移植瘤模型表明,携带miR-142-3p的外泌体可以在小鼠体内外抑制骨肉瘤细胞的增殖(P<0.001)。结论:携带miR-142-3p的外泌体可通过抑制COX-2的表达来抑制骨肉瘤细胞的生长,因此,携带miR-142-3p的外泌体可能发展成为一种治疗骨肉瘤的潜在策略。

miR-222-3p在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌血清外泌体中的表达及临床意义

目的探讨miR-222-3p在乙型肝炎病毒(HBV)相关肝细胞癌(HCC)血清外泌体中的表达及其与临床特征和预后的相关性。方法收集我院收治的604例HCC患者的临床病理资料,包括391例HBV-HCC患者(HBV-HCC组)和213例非HBV-HCC患者(非HBV-HCC组)。另选取288例慢性乙肝患者作为HBV组。采用实时荧光定量PCR法检测血清外泌体miR-222-3p表达水平,分析miR-222-3p表达与HBV-HCC患者不同临床特征的关系。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清外泌体miR-222-3p对HBV-HCC的诊断价值;采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验分析miR-222-3p表达水平与患者预后的相关性;采用Cox比例回归风险模型分析影响HBV-HCC患者预后的危险因素。结果HBV-HCC组患者血清外泌体miR-222-3p水平显著高于非HBV-HCC组和HBV组(P<0.001)。经ROC曲线分析,血清外泌体miR-222-3p用于HBV-HCC诊断(HBV-HCC组vs.HBV组、HBV-HCC组vs.非HBV-HCC组)的曲线下面积(AUC)分别为0.900(95%CI:0.878~0.922)、0.731(95%CI:0.692~0.771)。血清外泌体miR-222-3p的表达与患者HBV-DNA拷贝、天冬氨酸转氨酶(AST)、异常凝血酶原(DCP)、巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期有关(P<0.05)。HBV-HCC患者血清外泌体miR-222-3p高表达组和低表达组中位生存时间分别为2.66年、4.14年,总生存率分别为32.8%、35.7%(Log-rankχ^(2)=15.078,P<0.001)。经Cox比例风险回归模型分析,血清外泌体miR-222-3p表达水平升高是影响HBV-HCC患者预后的独立危险因素之一(P<0.05)。结论血清外泌体miR-222-3p与HBV-HCC的发生发展密切相关,其表达水平升高是影响HBV-HCC患者预后的独立危险因素。

心理应激致血浆外泌体miR-184-3p抑制血管内皮细胞增殖、迁移功能的作用分析

目的探讨心理应激源性血浆外泌体miR-184-3p在调控血管内皮细胞增殖、迁移功能中的作用。方法(1)将60只6~8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组和心理应激组,每组30只。采用21 d慢性不可预知性心理应激刺激建模。通过行为学实验(旷场实验、高架十字迷宫实验和强迫游泳实验)评价建模效果。提取血浆外泌体进行电镜分析,qPCR检测血浆外泌体miR-184-3p表达水平。(2)体外培养小鼠肺微血管内皮细胞(MPVEC),分别转染对照组小鼠血浆外泌体(C-EXO组)、心理应激组小鼠血浆外泌体(S-EXO组)、NC mimic组和miR-184-3p mimic组。划痕实验分析细胞迁移情况,EdU染色分析细胞增殖情况。结果(1)心理应激组小鼠探索行为较对照组显著降低,不动时间显著增加(P<0.01)。电镜分析验证血浆外泌体直径为30~200 nm的双层膜囊泡结构,qPCR证实心理应激组小鼠血浆外泌体中miR-184-3p的表达量显著增加(P<0.05)。(2)细胞实验结果显示S-EXO组细胞迁移和增殖能力较C-EXO组下降(P<0.01);同时miR-184-3p mimic组细胞增殖和迁移能力较NC mimic组下降(P<0.05)。结论慢性心理应激源性血浆外泌体可以通过介导miR-184-3p抑制血管内皮细胞的增殖和迁移。

血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌早期诊断价值

目的分析血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌的早期诊断价值。方法选择非小细胞肺癌病人120例为观察组,同期体检健康志愿者120例为对照组,均采集空腹静脉血,磷钨酸钠溶液染色后采用透射电镜观察外泌体形态,Western blot方法检测外泌体标志性蛋白CD81、TSG101表达,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测miR-486-3p水平,采用化学发光法检测血癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)水平,绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清外泌体miR-486-3p诊断非小细胞肺癌的灵敏度和特异度。结果透射电镜观察可见,外泌体呈盘状囊泡样结构,直径为20~300 nm,颗粒状。Western blot实验鉴定表面标志蛋白CD81、TSG101证实为外泌体。观察组血清CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1水平均高于对照组(t=10.701~31.406,P<0.01),miR-486-3p水平低于对照组(t=17.155,P<0.01);观察组高龄、男性、有淋巴转移病灶及TNM分期Ⅲ~Ⅳ期病人的miR-486-3p表达水平均低于中青年、女性、无淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅰ~Ⅱ期病人(t=8.168~19.658,P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清外泌体miR-486-3p诊断非小细胞肺癌的曲线下面积(AUC)为0.781,95%置信区间(CI)为0.724~0.839,灵敏度为51.67%,特异度为98.33%,最佳界值为0.945。结论血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌具有一定的早期诊断价值,血清外泌体miR-486-3p表达水平越低,非小细胞肺癌病人恶化程度越高。

高表达miR-132-3p间充质干细胞外泌体对缺氧/复氧受损脑微血管内皮细胞功能的改善作用

目的研究高表达miR-132-3p间充质干细胞(MSCs)释放的外泌体(EXs)对缺氧/复氧(H/R)受损内皮细胞功能的作用。方法原代培养从C57BL/6小鼠骨髓中提取的MSCs,采用装载miR-132-3p载体的慢病毒感染MSCs获得MSC^(miR-132-3p),同时采用装载有scramble序列的对照慢病毒感染MSCs获得MSC^(NC)。分离提取MSC^(NC)及MSC^(miR-132-3p)释放的EXs,分别获得MSC-EXs及MSC-EXs^(miR-132-3p)。将所得EXs与H/R受损小鼠脑微血管内皮细胞(bend3)共培养,根据培养条件将细胞分为正常培养组(细胞正常培养)、H/R组(制作H/R模型)、MSC-EXs处理组(MSC-EXs共培养)、MSC-EXs^(miR-132-3p)处理组(MSC-EXs^(miR-132-3p)共培养)、MSC-EXs^(miR-132-3p)+LY294002组[细胞与MSC-EXs^(miR-132-3p)共培养前加入磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)信号通路阻断剂LY294002(20μmol/L)处理]。实时荧光定量聚合酶链反应检测MSCs、MSC-EXs及bend3细胞中miR-132-3p的表达。血管形成试剂盒检测bend3细胞血管形成能力,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测bend3细胞增殖能力,划痕实验检测bend3细胞迁移能力,hochest33258染色显示细胞的凋亡,Western blot检测蛋白激酶B(Akt)的磷酸化水平。结果与H/R组相比,MSC-EXs处理组显著改善H/R诱导下bend3细胞受损的血管形成、增殖、迁移能力及Akt磷酸化水平[H/R组分别为(3±1)条、0. 275±0. 020、(147±8)μm和0. 89±0. 12; MSC-EXs处理组分别为(8±3)条、0. 358±0. 030、(218±10)μm和1. 37±0. 25,均P <0. 01],细胞凋亡明显减少[(47±2)%比(63±2)%,均P <0. 01]。与MSC-EXs处理组比较,MSC-EXs^(miR-132-3p)处理组bend3细胞的血管形成、增殖、迁移能力及Akt磷酸化水平增加[分别为(14±3)条、0. 444±0. 050、(357±10)μm和1. 67±0. 23,均P <0. 01],细胞凋亡明显减少[(34±1)%,P <0. 01]。与MSC-EXs^(miR-132-3p)处理组比较,MSC-EXs^(miR-132-3p)+LY294002组细胞的增殖、迁移、血管形成能力及Akt磷酸化水平明显减少[分别为(5±2)条、0. 304±0. 050、(175±8)μm和0. 95±0. 11,均P <0. 01]。结论高表达miR-132-3p的MSC-EXs能够通过激活PI3K/Akt信号通路改善H/R诱导受损脑血管内皮细胞多种生理功能。

脓毒症患者早期外周血外泌体中miR-1-3p的表达分析

目的本研究通过提取脓毒症患者与健康人的外周血中的外泌体,并对提取的外泌体中含有miR-1-3p进行荧光定量PCR(qRT-PCR)检测,探讨miR-1-3p与脓毒症关系。方法纳入2019年1月至8月本院重症医学科脓毒症患者17例,另取9例健康志愿者为对照组。按脓毒症诊疗常规处理,检测血常规、C-反应蛋白、降钙素原(PCT)、白介素6(IL6)等指标。患者及9例健康志愿者均留取2mL血样,并离心3000r/min15min,取上清液,置于-80°C冰箱中备用,将血清通过商业化试剂盒分别提取外周血中外泌体后,对外泌体中含有miR-1-3p表达进行荧光定量PCR检测。结果与健康者比较,脓毒症患者的外周血外泌体中miR-1-3p相对表达量明显增高,有统计学意义(P<0.001),另外患者外周血外泌体miR-1-3p相对表达量与外周血WBC、PCT、hsCRP缺乏相关性(P>0.05),而与IL-6具有明显相关性(r=0.514,P=0.035)。结论脓毒症患者外周血中外泌体miR-1-3p表达量增高,且与早期炎症指标IL-6相关性强,miR-1-3p可能参与了脓毒症早期炎症反应。

骨髓间充质干细胞源外泌体miR-21-5p通过下调PHLPP2促进前列腺癌PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)来源的外泌体对前列腺癌细胞PC-3的增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法:采用q PCR检测miR-21-5p在前列腺癌细胞系中的表达水平。采用电子显微镜观察BMSC分离出的外泌体形态,Western blotting检测外泌体表面标志物的表达以及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-21-5p和同源血小板富亮氨酸复重蛋白磷酸酶2(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2,PHLPP2)的靶向调控关系。向PC-3细胞培养液中加入10μl的BMSC外泌体悬液(Exo组)、转染sh-PHLPP2或antagomiR,CCK-8和Transwell实验检测PC-3细胞增殖和迁移能力。结果:miR-21-5p在前列腺癌PC-3细胞系中高表达。成功分离BMSC培养液上清中的外泌体,透射电子显微镜下观察到外泌体典型的囊泡状结构,且表达CD9、CD63和CD81等特异性蛋白。Exo组中PC-3细胞的增殖、侵袭[(421.34±22.45)vs(200.09±14.22)个,P<0.05]、迁移能力和N-cadherin、Vimentin和miR-21-5p的表达水平均显著高于对照组(均P<0.05)。证实PHLPP2是miR-21-5p的靶基因。与对照组相比,Exo组和sh-PHLPP2组PC-3细胞中PHLPP2的表达明显降低(0.66±0.09、0.42±0.05 vs 1.09±0.08,均P<0.01),细胞增殖、侵袭和迁移[(87.23±12.67)%、(82.45±10.13)%vs(66.46±9.13)%]能力均显著提高(均P<0.01),E-cadherin表达水平显著降低而N-cadherin和Vimentin表达水平显著升高(均P<0.05)。结论:miR-21-5p在前列腺癌PC-3细胞系中高表达,BMSC外泌体miR-21-5p通过靶向下调PHLPP2提高PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

慢性心力衰竭患者血浆外泌体miR-214-3p和miR-184的表达及意义

目的探讨慢性心力衰竭(CHF)患者血浆外泌体miR-214-3p、miR-184表达及意义。方法心力衰竭患者106例(心衰组)及健康者127例(对照组),利用实时定量PCR(qRT-PCR)对所有研究对象血浆外泌体miR-214-3p、miR-184表达水平进行检测,并分析其与临床特征[左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室短轴缩短率(FS)、左心室射血分数(LVEF)、血浆脑钠肽(BNR)]之间关系。结果CHF患者血浆外泌体miR-184表达水平显著低于对照组,miR-214-3p表达水平显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同心功能分级患者BNP、LVEDD、FS、LVEF水平,与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。随NYHA心功能分级(Ⅱ~Ⅳ)增加,CHF患者miR-184表达水平及FS、LVEF水平逐级降低,miR-214-3p表达水平及BNP、LVEDD水平逐级增高(P<0.05)。Pearson相关分析显示,CHF患者miR-214-3p表达水平与BNP、LVEDD呈正相关(r值分别为0.549、0.427,P<0.05),与LVEF呈负相关(r=-0.413,P<0.05);CHF患者miR-184表达水平与BNP、LVEDD呈负相关(r值分别为-0.525、-0.483,P<0.05),与LVEF呈正相关(r=0.397,P<0.05)。结论CHF患者血浆外泌体miR-214-3p表达水平升高,miR-184表达水平降低,与患者心功能有关,可能参与CHF疾病发生发展。