循环机械压力诱导下兔椎间盘退变器官模型的建立及意义

背景:力学因素是导致椎间盘退变(IDD)的重要诱因,建立力学相关性IDD的器官模型能为IDD机制的研究提供理想的模型基础。目的:建立兔椎间盘器官模型,并施以循环机械压力,探究循环机械压力载荷对IDD的影响。方法:6月龄新西兰大白兔随机分为加力组和对照组,静脉给予1.3 ml肝素(5000 U/ml),待肝素体内循环5 min后处死。无菌条件下完整取出带部分椎骨的腰段椎间盘,放入20%胎牛血清的培养液中培养。加力组应用加力器施以0.2 MPa压力值,每日加压1次,每次30 min。经过各个时段的培养后,苏木精-伊红(HE)染色观察椎间盘大体组织形态学变化;氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色及4',6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)复染检测椎间盘细胞成活率;Realtime RT-PCR和Western-blotting检测蛋白多糖(AGN)、Ⅱ型胶原(COLⅡ)的mRNA和蛋白表达。结果:对照组和加力组培养至第7 d的组织形态学无明显变化,培养至第14 d均表现为组织形态学破坏,且以加力组表现更为明显。对照组培养至第7 d的细胞成活率及AGN、COLⅡ表达与0 d相比无明显变化;对照组培养第14 d与0 d比较,培养第7 d加力组与对照组比较,培养第14 d加力组与对照组比较,均表现为细胞成活率明显下降,AGN、COLⅡ表达下调。结论:成功建立短周期兔椎间盘体外器官模型,并在此模型基础上阐明循环机械压力载荷可直接导致椎间盘退变样改变。

循环机械压力诱导下兔椎间盘器官模型ANK蛋白的表达

目的建立兔椎间盘器官培养模型，在此基础上施以循环机械压力（CMP），观察兔椎间盘器官细胞成活率、组织形态学的变化及ANK蛋白的表达情况，并观察外源性转化生长因子（TGF）-β1，对ANK蛋白表达的调控作用。方法6月龄新西兰大白兔随机分为加力组和对照组，无菌条件下完整取出带部分椎骨的腰段椎间盘，放人含有20％胎牛血清的培养液里进行培养。加力组椎间盘应用加力器对其施以0．2MPa压力值，每日1次，每次30min。2组器官模型培养选取0、7、14天3个时间点，HE染色观察大体组织形态学变化；氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染检测细胞成活率；Western blot检测ANK蛋白的表达。另外，在加力组培养至第7天时，培养液中加入外源性TGF—β1再培养4h，Western blot检测ANK蛋白的表达。结果对照组培养至第7天时，其组织形态学、细胞成活率及ANK蛋白的表达与0天相比差异无统计学意义（P〉0．05）；培养至第14天时，组织形态学破坏，细胞成活率下降、ANK蛋白的表达下调，差异有统计学意义（P值均〈0．05）。加力组培养至第7天时，组织形态学无明显变化，但细胞成活率下降、ANK蛋白的表达下调（P值均〈0．05）；培养至第14天时，组织形态学破坏、细胞成活率下降及ANK蛋白的表达下调均更明显（P值均〈0．05）。另外，加力组培养至第7天时加入外源性TGF—β1后，ANK蛋白的表达上调（P〈0．05）。结论CMP载荷可明显增加兔椎间盘器官模型细胞和组织学结构的破坏，使ANK蛋白的表达明显下调，可能与椎间盘退变的发生、发展密切相关。而外源性TGF—β1对ANK蛋白的表达具有正向调控作用，可能对CMP作用导致的退变椎间盘具有一定的修复作用。

短时间机械循环压力对3D培养脊柱终板软骨细胞的影响

目的:探究短时间的机械循环压力对终板软骨细胞的影响,并探讨其机制。方法:大鼠终板软骨细胞的分离制备大鼠终板软骨细胞琼脂糖模板进行培养,然后通过FX-5000T对大鼠终板软骨细胞琼脂糖模板加载短时间的机械循环压力。通过活死染色对细胞进行活死分析,通过RT-PCR和Western blotting检测ANK基因表达。通过RT-PCR和ELISA检测TGF-β1的表达。结果:大鼠终板软骨细胞加载短时间的机械循环压力后ANK基因和TGF-β1表达量增加,加载短时间的机械循环压力的实验组跟实验对照组活死染色没有显著改变。结论:短时间的压力刺激下终板软骨ANK基因和TGF-β1表达量上调抑制终板软骨的退变,短时间的压力刺激并不影响终板软件细胞的活死。这个实验结果可能在椎间盘退变的防治中提供一种新的方法。

自噬机制在大鼠终板软骨退变进程中的作用

目的:探讨机械循环压力(PCMT)处理不同时间对大鼠终板软骨细胞钙化的影响,以及自噬在大鼠终板软骨退变过程中的作用以及相关分子机制。方法:将获得的终板软骨细胞分为正常细胞组(A组)、单纯雷帕霉素(RAPA)干预组(B组)、单纯PCMT干预组(C组)、RAPA联合PCMT干预组(D组),各组采取相应的方法干预7和14 d天后,利用茜素红S法检测钙含量,ELISA法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,real time-PCR检测自噬相关基因Beclin-1、LC3基因以及胶原蛋白(Collagen)Ⅱ型,蛋白多糖(Aggrecan)以及SOX9基因表达,Western blot检测Beclin-1及LC3蛋白表达。结果:干预第7天时,各组细胞钙含量差异无统计学意义(P>0.05),干预第14天时C组钙含量显著高于A组、B组及D组(P<0.05);干预第7和14天时,C组ALP活性显著高于A组、B组及D组(P<0.05);干预第7天时C组Beclin-1、LC3基因及蛋白表达水平显著高于A组,低于B组及D组(P<0.05);而第14天时C组Beclin-1、LC3基因表达水平显著低于A组和B组及D组(P<0.05),C组CollagenⅡ、Aggrecan、SOX9基因表达水平在两个时间点均显著低于A组、B组及D组(P<0.05)。结论:长期的PCMT可致终板软骨钙化,自噬可抑制大鼠终板软骨退变进程,其机制可能与自噬相关Beclin-1、LC3基因及蛋白表达升高有关。