双链DNA模板循环测序的研究

采用末端标记引物法进行双链DNA循环测序是实验室快速、准确获得双链DNA模板序列的有效方法。实验结果表明：该测序法不仅能消除由于模板不纯所导致的引物的非特异性结合等因素而产生的非特异条带，而且能降低PCR产物测序的背景问题。

影响荧光终止法PCR循环测序反应的因素

比较了一些影响荧光终止法PCR循环测序反应的因素。实验结果显示在BeckmanCEQ2 0 0 0自动测序仪上 ,可读序列长度随着pUC18模板量增加而逐渐增多 ,当模板量达到 12 5ng时DNA可读序列最长 ,以后随着pUC18量增加测序长度逐渐下降。当引物量是 1μl时 ,其测序结果比用 0 .5μl引物时好。在同样模板量情况下 ,10 μl反应体积比 5

DNA循环测序中一些常见影响因素的研究

目的 研究 DNA循环测序中一些常见因素的影响。方法 对循环测序中模板、引物、测序反应条件及其产物的纯化等常见因素进行了比较研究。结果 测序模板浓度过低 ,则核苷酸曲线的信∶噪比小 ,甚至不出现荧光信号。模板浓度过高 ,判读的核苷酸长度降低 ;引物的长度、G+C含量及 Tm值对测序结果无明显影响 ;模板中的离子对测序反应有抑制作用 ;改变变性、退火及延伸温度 ,以及加入二甲基亚砜(DMSO)或甘油对某些 DNA模板的序列测定有较好的效果 ;测序反应产物纯化后如有残余的荧光染料 ,则会干扰测序仪对核苷酸的自动判读 ,但序列能进行人工校正。结论 序列质量与模板的纯度、浓度有明显的关系。对一些具有特殊结构 DNA,调整循环反应条件或使用添加剂能获得较好测序结果 ;利用 70 %乙醇沉淀法是首选的测序反应产物纯化方法。

DNA循环测序中的影响因素和图例分析

目的 通过对 2 0 40份样品的DNA测序 ,回顾性分析和研究DNA循环测序过程中一些影响因素及其序列图谱。方法 对测序中模板、引物、测序反应条件及其产物的纯化等因素进行比较研究。结果 模板因素是测序成败的主要原因 ,占测序失败的 70 %。模板的质量直接影响着测序图谱 ,模板纯度不够 ,序列曲线表现为可读序列短 ,开始时波峰过高不易判读 ,然后峰值迅速降低 ,并有噪峰出现 ,信号减弱 ,在原始资料中核苷酸曲线的波峰扁平或者没有信号。模板浓度过高 ,序列曲线呈现头重脚轻 ,可读序列短 ;而浓度过低 ,则信号衰减。引物问题引起测序失败占 15 4% ,主要原因为引物失效 ,与模板匹配不完全 ,Tm值过低等因素。利用 75 %异丙醇沉淀纯化测序反应产物 ,效果好且简单 ,经济。结论 测序的质量与模板的纯度、浓度有着直接的关系 ,在大规模的测序中 ,推荐使用异丙醇沉淀法。

一种新的DNA测序法——双链DNA循环测序技术

DNA测序是常用的分子生物学技术,自PCR(polymerase chain reaction)技术问世后,DNA测序也出现了一次大的变革,从过去的分子克隆测序进入扩增产物的直接顺序测定的新阶段。最近国外又发展了一种叫做双链DNA循环测序法(dsDNA

DNA测序证实的Wilson′s病ATP7B基因第14外显子一种新型移码突变

目的：了解中国人肝豆状核变性患者基因（ＡＴＰ７Ｂ基因） 第１４ 外显子（ｅｘｏｎ１４） 的突变情况，为该病的基因诊断和治疗提供依据。方法：用聚合酶链反应（ＰＣＲ） 扩增ＡＴＰ７Ｂ基因的第１４ 外显子片段，通过ＤＮＡ 单链构象多态（ＳＳＣＰ） 筛选，以ＰＣＲ产物（ＰＣＲＤＮＡ）循环测序予以鉴定。结果：在８５ 例肝豆状核变性患者和３９ 例正常人的ＰＣＲＳＳＣＰ均呈现两种泳动带型（ Ⅰ、Ⅱ型） ，我们分别对两组中各种带型的ＰＣＲＤＮＡ进行循环测序，发现Ⅱ型中ＷＤ 患者第１０４６ 密码子后插入了碱基Ａ（１０４６ｉｎｓＡ） 而产生移码突变。结论：肝豆状核变性患者中发现一种未见报道的新型移码突变。

以病毒的230 kb DNA分子为模板的DNA序列测定

目的:为确认Tn3-gpt已插入小鼠巨细胞病毒(mousecytomegalovirus,MCMV)基因组的特定位置,改进大分子病毒DNA的测序方法,建立以230kbDNA为模板直接进行DNA序列测定的方法。方法:待测MCMV的Tn3-gpt插入突变株感染NIH3T3细胞后,从培养液中制备病毒颗粒并从中纯化得到基因组DNA,以此DNA为模板,合成的寡核苷酸为引物,用热循环方法按Promega公司的DNACycleSequencingSystem试剂盒的方法进行测序。结果:获得纯度较高可直接作为模板进行测序的DNA,测序所得放射自显影图片条带清晰明亮,间隔正常,分辨率较高,可顺利读出插入位点的MCMV的DNA序列,证实Tn3-gpt插入在特定的位置。结论:长达230kb的大分子病毒DNA可直接作为模板,用热循环测序方法进行测序,无需切割成小片段后才进行测序。

人白细胞抗原一DPB1基因直接测序分型技术

研究建立准确的基于人白细胞抗原一ＤＰＢ１（ＨＬＡ－ＤＰＢ１）核酸序列的基因分型技术，为疾病与ＨＬＡ基因相关性研究及器官、组织移植提供准确的ＨＬＡ基因分型方法。使用第十一届国际组织相容性会议提供的引物，经ＰＣＲ技术扩增、分离相应的基因片段，纯化后用ＰＥ公司四色荧光染料终止剂标记循环测序技术直接测定核酸序列，获得个体基因型序列资料，通过与基同型资料数据库比较确定基因型别。这一技术可以准确地确定个体的 ＨＬＡ－ＤＰＢ１的基因型别并得到核酸序列。为进一步研究奠定了基础。本技术可用于其它类似的研究工作。

MALBAC-NGS和array CGH检测染色体异常囊胚的结果比较

目的比较基因组杂交微阵列芯片(array CGH)与多次退火环状循环扩增-二代测序(MALBAC-NGS)两种方法进行胚胎植入前染色体筛查的结果差异。方法收集西北妇女儿童医院生殖中心行胚胎植入前遗传学筛查/诊断(PGS/PGD),并经array CGH(BlueGnome 24SureV3软件)检测异常的囊胚(共32枚),复苏培养后再次活检,通过MALBAC-NGS的方法进行胚胎染色体非整倍体筛查,比较两种不同检测方法的结果差异。结果32枚囊胚中,内细胞团与外胚层分别活检的有16枚,通过MALBAC-NGS的方法检测,内细胞团与外胚层检测结果完全一致的为14枚,一致率87.5%(14/16);2枚囊胚内细胞团与外胚层部分不一致,不一致率12.5%(2/16)。32枚囊胚中,两种方法检测结果完全一致的有7枚,一致率21.87%(7/32);array CGH法检测为染色体异常的囊胚中,其中有15枚囊胚MALBAC-NGS法检测为正常(46XN),array CGH的假阳性率46.88%(15/32)。array CGH法检测染色体嵌合的胚胎数为0,MALBAC-NGS检测出染色体嵌合的胚胎数为3枚,嵌合率9.37%(3/32)。结论与array CGH法相比,MALBAC-NGS法检测能够降低假阳性率,嵌合检出率高。MALBAC-NGS法检测囊胚内细胞团与外胚层的整倍体一致性较高。

单克隆抗体可变区基因PCR扩增产物的直接测序

利用一组通用引物对单克隆抗体可变区ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。扩增产物经纯化后通过一个以链终止法为基础的“循环测序”程序直接进行序列测定，其中所用四种双脱氧核苷酸分别带不同的荧光标记，测序引物选自同一组通用引物。测序电泳和数据收集在ＤＮＡ测序仪上进行。本法简单、快速、准确，是解析抗体可变区序列的有效手段。

不同指征患者胚胎植入前非整倍体筛查的比较

目的通过对进行植入前遗传学筛查(PGS)患者的胚胎和染色体结果分析,比较不同PGS指征在胚胎染色体非整倍体的差异。方法收集2018年6月1日至2018年11月30日在西北妇女儿童医院生殖中心行PGS患者288例,胚胎培养囊胚期活检,PGS检测采用多次退火环状循环扩增技术-二代测序技术(MALBAC-NGS),比较不同年龄段、不同性别患者和不同PGS指征胚胎染色体非整倍体率。结果①PGS共活检288枚胚胎,最终有效检出结果的胚胎数为275枚。其中整倍体胚胎数目为141(51.27%),非整倍体胚胎数目为134(48.73%)。②在染色体异常的胚胎中以异常染色体数目为1条(42.54%)和2条(37.31%)最为常见。染色体异常的女性患者产生非整倍体胚胎数目为43个(59.72%),染色体异常的男性患者产生非整倍体胚胎数目为59个(49.17%),不同性别患者的整倍体率与非整倍体率比较无统计学差异(χ^2=2.01,P>0.05)。③随着女方年龄的增长,胚胎非整倍体率逐渐升高,≤27岁、28~30岁、31~33岁、34~36岁和≥37岁患者非整倍体胚胎数目分别为34个(43.04%)、43个(52.44%)、37个(59.68%)、10个(32.26%)、12个(57.14%)。然而,不同年龄女性患者的胚胎整倍体率与非整倍体率比较无统计学差异(χ^2=8.35,P>0.05)。④在不同PGS指征中,以相互易位(36.84%)和复发性流产(RSA,占18.60%)最为常见。相互易位、罗氏易位、倒位、非整倍体及衍生染色体患者产生的非整倍体胚胎数目分别为71个(67.72%)、8个(40.00%)、2个(66.67%)、11个(42.31%)和7个(77.78%);不良孕产史、反复种植失败、RSA患者产生的非整倍体胚胎数目分别为11个(39.29%)、2个(22.22%)、24个(45.28%);不同PGS指征患者的整倍体率与非整倍体率比较具有统计学差异(χ^2=23.94,P<0.05)。⑤胚胎染色体异常中11、13、14、22号染色体及性染色体异常发生率较高(分别占9.19%、10.95%、6.71%、6.01%、8.83%)。结论通过对PGS患者的染色体结果分析得出,随着年龄的增长,胚胎非整倍体率逐渐升高。在不同PGS指征中,以相互易位和RSA最为常见。平衡易位、倒位、衍生染色体等双亲染色体异常可能更易导致胚胎染色体非整倍体。染色体异常的胚胎中以异常染色体数目为1条和2条最为常见。染色体异常的女性患者胚胎非整倍体率较高。

A model-based driving cycle test procedure of electric vehicle batteries

The battery test methods are the key issues to investigate the energy-storage characteristics and dynamic characteristics of electric vehicle(EV) batteries.In this paper,the research advances of existing battery test methods as well as driving cycles are reviewed.An electric vehicle model that consists of EV dynamics model,battery model and electric motor model is built.The dynamic characteristics of the battery in frequency domain are analyzed.Based on the EV model and the frequency domain characteristics of the battery,a driving cycle test procedure of EV battery is proposed.The battery test procedure is able to reflect the real-world characteristics of EV batteries,and can be used as a universal EV battery test method.