去细胞化全肝生物支架循环灌注培养条件下体外细胞再植

背景:通过去细胞化技术制备全肝生物支架成为缓解供体短缺的新技术,优化肝脏组织的去细胞化流程成为新的课题。目的:通过去细胞化技术建立完整保留肝脏三维结构和脉管系统的全肝生物支架,利用自主设计的循环灌注培养装置实现生物支架体外细胞再植。方法:通过门静脉路径循环灌注去垢剂TritonX-100,十二烷基硫酸钠,并用磷酸盐缓冲液洗脱残留去垢剂。通过动态循环灌注培养装置进行支架与HepG2细胞的共培养,观察植入细胞在全肝生物支架内的功能表达。结果与结论:经去垢剂灌注后,支架呈现保持肝脏三维结构的透明结构,苏木精-伊红染色以及扫描电镜结果显示细胞成分被完全移除,Masson’sTrichrome染色可见大量胶原纤维,免疫组化结果证实纤维连接蛋白和层粘连蛋白保存完整。循环灌注培养下细胞白蛋白表达量及尿素合成量较平板培养明显提高。说明去细胞化肝脏生物支架可作为体外肝脏组织重建的基础材料,动态循环灌注方法可实现支架中细胞再植。

生物反应器中PRRSV工业规模增殖工艺的建立

分析比较了3种不同微载体悬浮培养工艺——分批换液式、消化传代放大式、循环灌注培养式对Marc-145细胞微载体培养效能及生理代谢的特点及差异,并实现了从5 L至60 L反应器放大过程的PRRSV实际增殖应用。结果表明,在5 L动物细胞反应器中使用相同的微载体用量6 g/L,分批换液式培养和消化传代放大式培养仅获得27×105~28×105cells/m L的细胞密度,低于循环灌注培养式的培养能力(59.4×105cells/m L)。根据这3种不同培养工艺的特点,设计并实施了可应用于实际生产的工艺流程,即Marc-145种子细胞以循环灌注培养方式在5 L反应器中完成初级培养,经消化传代工艺,将种子细胞放大接种于60 L反应器中进行分批换液式的二级培养,用于PRRSV的大规模增殖,结果显示PRRSV增殖滴度可达到108.3TCID50/m L。该过程成功地模拟了Marc-145细胞在工业级水平上的放大培养操作工艺,其放大倍数达到1∶3的传代系数,具备实际应用价值。

内皮祖细胞血管化大鼠肝脏脱细胞支架的研究

目的制备大鼠肝脏脱细胞支架及原代培养大鼠骨髓源性内皮祖细胞，用内皮祖细胞血管化大鼠肝脏脱细胞支架。方法采用灌注法制备大鼠肝脏脱细胞支架，苏木素-伊红（HE）染色法、免疫组织化学检测脱细胞支架结构及成分；原代培养并鉴定大鼠骨髓源性内皮祖细胞，并通过CD31、CD133、血管内皮生长因子（VEGF）免疫荧光鉴定；构建循环灌注培养体系；采用经门静脉途径将内皮祖细胞种植于脱细胞支架内，行体外循环灌注培养，通过HE和CD31检测内皮祖细胞在支架内生长情况。结果采用灌注法获得大鼠肝脏脱细胞支架，HE未见细胞核成分，同时可见细胞外基质成分保留，免疫组织化学显示Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白保留；原代培养的大鼠骨髓源性内皮祖细胞CD31、CD133、VEGF免疫荧光阳性；构建出由蠕动泵、氧合器、培养瓶、输送管道组成的循环灌注培养体系；成功将内皮祖细胞通过门静脉途径种植到脱细胞支架内，HE、CD31显示内皮祖细胞定植于脱细胞支架管腔内壁。结论通过循环灌注培养能够成功将原代大鼠内皮祖细胞种植于大鼠肝脏脱细胞管腔内壁。