利用CRISPR/Cas9技术构建 MLH1 基因敲除结肠癌细胞Mc38和乳腺癌细胞4T1及其微卫星状态鉴定

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定鼠源性结肠癌细胞Mc38和鼠源性乳腺癌细胞4T1,为研究微卫星不稳定肿瘤在抗肿瘤免疫治疗过程中的作用机制提供细胞模型。方法:设计2条特异性靶向MLH1基因的SgRNA序列,构建lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体,经PCR、测序鉴定;将lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体分别和慢病毒包装骨架质粒pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞构建lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒载体;利用lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒载体分别感染Mc38、4T1细胞,经嘌呤霉素和96孔板流式分选筛选出阳性单克隆细胞后PCR、Western Blot和测序鉴定;MLH1-/-Mc38细胞、MLH1-/-4T1细胞连续培养约70 d,经荧光PCR-毛细管电泳进行微卫星状态检测,筛选MLH1基因敲除的微卫星不稳定Mc38、4T1细胞。结果:测序结果表明成功构建lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体;PCR、Western Blot和测序结果表明成功构建MLH1-/-Mc38细胞、MLH1-/-4T1细胞;荧光PCR-毛细管电泳结果表明成功构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定Mc38、4T1细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定鼠源性结肠癌细胞Mc38和鼠源性乳腺癌细胞4T1,为后续深入研究微卫星不稳定肿瘤在抗肿瘤免疫治疗过程中的作用机制奠定了基础。

新辅助免疫在微卫星高度不稳定胃肠肿瘤中的应用分析

本文旨在分析,在微卫星高度不稳定胃肠肿瘤(英文全称:microsatellite instability-high,英文简称:MSI-H)患者治疗,采用术前新辅助免疫进行治疗,对患者病情改善产生的影响。方法:研究对象:胃肠肿瘤患者(70例);收治时间:2018年3月开始,2020年12月结束。组别情况(依据患者肿瘤类型不同分组):MSI-H患者纳入MSI-H组(35例)、非MSI-H患者纳入对照F组(35例)。治疗方法:新辅助免疫疗法治疗1周。疗效鉴别:于患者治疗前后,观察细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(英文简称:CTLA-4)、肿瘤微环境CD4、肿瘤微环境CD8、程序性死亡受体配体-1(英文简称:PD-L1)、叉头框蛋白P3(英文简称:FOXP3)情况。结果:MSI-H组、对照F组治疗前(VS)治疗后1周,CD4+TIL、CD8+TIL、CTLA-4+TIL升高明显(P<0.05),PD-L1+TIL下降明显(P<0.05),FOXP3+TIL无明显变化(P>0.05)。MSI-H组(VS)对照F组,前者PD-L1+TIL阳性率更高(P<0.05)。结果:新辅助免疫治疗方式,应用在MSI-H治疗中效果明显,且MSI-H患者PD-L1+TIL阳性率更高,在使用PD-L1阻断剂进行新辅助免疫治疗时,效果更优。