三角帆蚌微卫星富集文库的构建、鉴定及多态性分析

通过磁珠富集法构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)微卫星富集文库。共获得800个阳性克隆,其中的100个阳性克隆经测序分析,共获得微卫星序列54个。利用这些微卫星序列可设计33对引物,经过PCR扩增筛选获得了25对可用引物。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对洞庭湖1个种群的30只三角帆蚌进行扩增,发现13对引物呈现多态性,等位基因数在4～9。观测杂合度在0.2543～0.9827,期望杂合度在0.3629～0.8217,信息多态含量平均为0.5198。由于存在无效等位基因,两个微卫星基因座(GenBank登录号为GQ302651和GQ302658)明显地偏离哈代-温伯格平衡,但没有发现连锁不平衡现象。这说明利用磁珠富集法构建的三角帆蚌微卫星文库质量较好,13对多态性微卫星引物可为三角帆蚌微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、分子标记辅助育种以及经济性状的QTL定位提供帮助。

一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA文库构建方法

针对SMART方法中PCR扩增削减了大片段基因所占比例，使文库中很难获得大片段克隆的问题，进行了方法改进。在原始SMART方法的基础上，以大豆叶片为材料，通过琼脂糖凝胶分级分离技术，将PCR扩增后合成的dscDNA分成3个等级，分别与载体连接、转化，构建相应亚库，每个亚库容量在1．0×10^6左右，重组率接近99％。改进方法所建文库的平均全长率53．6％，与改进前的（52．2%）相当。插入片段范围为0．5～3．5kb，最大插入片断长度比改进前的提高1．5kb。该方法提高了SMART方法中大片段克隆的获得率，为大豆功能基因组学研究提供了保障。

肿瘤坏死因子(TNF)基因的体外扩增

获得目的基因的方法很多，如构建cDNA文库，构建基因组文库，人工合成目的基因，PCR(聚合酶链反应)合成及差异显示与基因陷阱等。本实验采用PCR法从已知TNF(肿瘤坏死因子，从上海第二军医大学获得)的全基因序列中扩增获得。

基于PCR的SSR标记分离方法综述

SSR分子标记是目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。SSR标记具有物种特异性,要应用该方法需要提前开发相应物种的特异SSR标记,而获得微卫星标记的经典方法是通过构建基因组片段文库和特殊标记SSR探针杂交法获取,这些方法经济成本相对较高且耗时耗力。近年来,该领域的研究中积累了很多研究成果和技术改进,发展起来几种基于PCR简便易操作且节约成本的SSR标记分离方法,例如基于RAPD的微卫星分离方法、基于ISSR抑制PCR扩增法、序列标签微卫星分析法、选择性扩增微卫星分析法以及荧光ISSR-PCR分离微卫星和微卫星扩增文库法等。本文主要对这些方法逐一进行综述,旨在为各个物种SSR标记的开发提供参考。

用SAM法分离谷子SSR位点的研究

首次将SAM(选择扩增微卫星)法用于谷子SSR位点的分离,共获得163个含有SSR序列的克隆,其中unique SSR 106个,占所有SSR序列的65%,60个SSR序列的3′端成功设计特异引物,占unique SSR的56%。这60个SSR序列中,55个为完整型重复;5个为复合型重复,由2种不同的重复单元组成,没有发现不完整重复类型。同时讨论了SAM法在应用过程中应注意的一些关键技术环节,如接头连接、核苷酸选择策略、特异引物设计原则,及该方法存在的一些不足,如获得SSR重复次数少、一端侧翼序列缺失对扩增多态性的消极影响等。

鲫鱼基因组DNA提取方法的探讨

以鲫鱼的血液、肌肉、肝、肾为材料,采用苯酚-氯仿法、试剂盒法提取鲫鱼基因组DNA,对不同方法提取的结果进行了紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳、微卫星PCR扩增等方法的鉴定。结果表明不同方法提取的鲫鱼基因组DNA浓度在385.8～3167.5ng/μL,A260/280比值处于1.66～1.87,所提取的DNA适合微卫星PCR扩增。因此,用苯酚-氯仿法对鲫鱼的血液、肌肉、肝、肾,用试剂盒法对鲫鱼的血液均能提取鲫鱼基因组DNA。

cDNA文库的构建策略

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用 .近年来 ,随着分子生物学技术的发展 ,cDNA文库构建方法有了很大改进和提高 .

真核生物中分离目的基因的方法及研究进展

介绍了有关在真核生物中分离所要研究的目的基因的主要策略和进展,这些方法包括:物理方法、化学合成法、构建基因cDNA文库、基因扩增技术(PCR、NASBA)和计算机辅助技术等。