微卫星PCR扩增反应技术条件优化探讨

微卫星PCR扩增反应受诸多因素的影响,不同的Mg2+浓度、退火温度、引物浓度、dNTP浓度、模板量、不同厂家的TaqDNA聚合酶、不同的PCR仪等都会对扩增反应结果有不同程度的影响。在进行PCR反应前,须对这些条件反复摸索优化,以获得最佳反应体系。

旋转式三温区微流控PCR扩增平台的研制

微流控芯片用于聚合酶链式反应(PCR)可提高检测效率和自动化程度,但目前把核酸提取、扩增、检测功能集成到一块芯片上仍比较困难,此外,微流控芯片专用PCR仪也存在温度控制不够快速、精准的问题。作者采用空间上温度循环代替时间上温度循环的设计思路,搭建了一套旋转式三温区微流控PCR扩增平台,对大肠杆菌进行核酸提取和扩增。结果表明,旋转式三温区微流控PCR扩增平台拥有较好的热均匀性和热稳定性,平台的升降温速率分别为3.5℃/s和2.67℃/s,单次循环时间为110 s。与9700型PCR仪相比,所建平台的温度控制方案更为简单、升降温速率更高、循环时间更短。本研究结果可为实现核酸提取、扩增一体化的微流控PCR设备的研发提供参考。

二核苷酸微卫星PCR扩增的影子带及其来源

2个绵羊二核苷酸微卫星BM143和BMS2508的PCR扩增产物在非变性(中性)聚丙烯酰胺凝胶电泳(nPAGE)中形成滞后于主带的影子带。影子带比主带小2 bp。实际上主带由两部分组成:表明微卫星正确大小的PCR特异扩增的高浓度条带(特异扩增带)和比特异扩增带小2 bp的PCR非特异扩增的低浓度条带(非特异扩增带)。本试验初步证明影子带是微卫星的一条特异扩增带和一条非特异扩增带错配形成的异源双链。本研究结果表明,影子带的出现并不改变特异扩增带在nPAGE中的正常迁移率。

猪微卫星标记多重PCR扩增组合

采用多重PCR的方法,以快速扩增微卫星标记和节约试剂为目标,对其反应条件进行优化后,获得了46个扩增效果理想的微卫星标记多重PCR组合,其中30个为二重PCR,16个为三重PCR。实验结果表明,这些多重PCP反应的引物浓度为0.06～0.3μmol/L,Mg2+的浓度变化范围为1.5～3.0mmol/L,采用的PCR缓冲液的倍数为1.0、1.2、1.4或1.6,每个PCR反应聚合酶的用量在0.2和0.4U之间,退火温度及反应循环数分别为52～60℃和32～50℃。所有多重PCR进一步合并为17个可在ABI337测序仪上进行电泳的组合。

正交设计微卫星PCR扩增条件的探讨

综述了影响微卫星PCR扩增的因素及正交设计原理 ,并以TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物、Mg2 +等 4种因素 3种水平为例 ,利用正交表L9( 34 )对扩增体系的优化进行探讨。

对赤点石斑鱼多态性微卫星位点的跨种扩增和特征分析

利用近缘种中已发表的微卫星DNA标记引物，对赤点石斑鱼（Epinephelus akeaara）进行跨种PCR扩增，得到12个多态位点，其等位基因数目从2到20不等；表观杂合度范围是0．22240．861，平均为0．595；期望杂合度范围是0．20040．932，平均为0．637．数据分析结果表明，在经过邦佛伦尼校正（Bonferronicorrection）后，这些微卫星位点均符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium），并且各位点两两之间不存在显著的连锁不平衡（1inkagedisequilibrium）现象．阂此可以认为，这12个多态性微卫星位点是研究赤点石斑鱼种群遗传结构的良好分子标记．

DMSO对PCR扩增反应的影响

为解决扩增δ -受体基因屡次失败的问题 ,观察了在PCR体系加入不同浓度DMSO时对DNA扩增反应的影响 .结果表明 :一定浓度的DMSO可显著提高PCR扩增的特异性和扩增效率 .

猪不同基因组DNA模板来源和浓度与微卫星位点扩增效果的比较研究

[目的]探讨全部使用猪毛发作为试验材料进行遗传多样性研究的可行性。[方法]以贵州黔北黑猪中的3头成年母猪为试材,分别拔取100、200根毛发和抽取5 ml全血进行DNA提取。以微卫星引物S0225和S0227为引物,设置1.0、2.5、5.0 ng/μl 3种模板浓度进行PCR扩增。[结果]采用2.5、5.0 ng/μl的模板浓度均可获得较好的PCR产物,用于聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增基因有较好的分辨效果。毛发DNA和血样DNA的PCR产物数量和质量均无明显差异。毛发数量与所提取DNA的浓度无直接关系。利用21个全毛样PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,均可观察到清晰的条带。[结论]该研究进一步证明全毛样DNA可作为猪遗传多样性研究的材料。

蚕微卫星DNA体外自我扩增条件初步研究

采用一种类似PCR的基因组自我引发PCR(GSP PRC)法 ,初步研究了家蚕、野桑蚕、天蚕、蓖麻蚕和柞蚕的微卫星DNA的体外基因组自我引发PCR扩增条件。质量浓度为 10 0mg/L的基因组DNA经 10 0℃变性 15min后 ,与等量相同浓度未变性的DNA混合作为模板 ,在 80 μL扩增体系 [含 0 2mmol/LdNTPs、5 0mmol/LKCl、10mmol/LTris HCl(pH 9 0 )、4mmol/LMgCl2 、1 2 5UTaqpolymerase]中加入 1μL此混合模板 ,在92℃、1min→ 5 5℃、2min→72℃、2min ,30～ 90次累积循环的扩增条件下 ,成功地得到了PCR产物。反应体系中 ,基因组DNA的适宜质量浓度为 1 2 5mg/L。GSP PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后的部分片段回收后 ,在同样条件下 ,30～ 6 0个循环可得到同样大小范围的产物。GSP PCR产物经 6 %的变性测序胶电泳 ,得到典型的梯状带 ,表明为微卫星DNA。

DNA体外扩增技术的突破——聚合酶链反应(PCR)的发展与应用

过去,人们为了从生物材料中获得某一段特定的DNA(基因)顺序或者进行其顺序分析或鉴定,需要经过非常繁琐的步骤并耗费大量的时间,而且往往还会由于所从事样品的复杂性、不均一性或含量太少而无法达到目的。最近由美国Cetus公司人类遗传部的一个小组研究和发展起来的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)

五引物单管聚合酶链反应（PCR）扩增法快速测定人CYP2D610等位基因的类型

以人CYP2D6 10等位基因位点为研究对象,建立了一种由5条引物同时PCR扩增在单管中进行等 位基因快速检测的新方法。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上,在内引物3′端引入了一个人工错配 碱基并在5′端附加一段“尾巴”作为引物的锚定部分,使扩增反应的特异性得到了提高。本实验所建立的方 法可在单管中同时完成SNP3种可能等位基因类型的快速检测。实测了47份样品的CYP2D6 10等位基因 的类型,并随机对其中20份样品的测定结果用RFLP法进行了验证,结果完全一致。结果表明本法简便、快 速,结果准确。

DNA片段体外扩增技术——聚合酶链式反应(PCR)的原理与应用

随着分子生物学的发展,对特定核甘酸片段进行分离。纯化及扩增已成为基因分子生物学研究的中心问题。过去,人们为了从生物材料中获得某一段特定的DNA(基因)顺序或者进行其顺序分析或鉴定。

蚕微卫星DNA的体外自我扩增条件初步研究

采用一种类似PCR的基因组自我引发PCR(GSP—PCR)法，初步研究了家蚕、野蚕、天蚕、蓖麻蚕和柞蚕的微卫星DNA的体外基因组自我引发PCR扩增的条件。结果发现。浓度为100ng/μl的基因组DNA在100℃变性15min后，与等量的同浓度的未变性的DNA混合作为模板。在80m扩增体系中[含0．2mM dNTPs、50mM KCl、10mM Tris—HCl(pH9．0)、4mM MgCl2、1．25U Tap plymerase]，加入1μl此混合模板，在92℃，1min→55℃，2min→72℃，2min，30→90次循环的扩增条件下，成功地得到了PCR产物。基因组DNA的适宜浓度为1．25ng/μl反应体系；GSP—PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后的部分片段经回收后，在同样条件下，30—60个循环可得到同样大小范围的产物。GSP—PCR产物经6％的变性测序胶电泳，得到典型的梯状带，表明为微卫星DNA。

影响多重PCR扩增效果的因素

不同循环参数、PCR缓冲液及反应体积的对比实验表明,循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR的扩增效果,而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。

流动型微流控PCR扩增芯片的研究

组装了由注射泵进样系统、微流控芯片和三温区加热器组成的流动型 PCR扩增系统 ,该系统具有扩增速度快、交叉污染小、芯片可重复使用和操作方便等特点 .优化了芯片厚度、隔热材料和流速等影响 PCR扩增的因素 .在 4 .9min内经 2 4个循环成功地扩增了浓度为 1 ng/1 0 0μL的λ-DNA( 5 0 0 bp) .

多聚酶链反应（PCR）扩增技术检测生肉中单核细胞增生性李斯特氏菌

多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增技术检测生肉中单核细胞增生性李斯特氏菌杜蔷，任保国北京市卫生防疫站（１０００１３）单核细胞增生性李斯特氏菌（以下简称单增李斯特氏菌）是影响食品卫生的重要病原菌，可以引起食物中毒的李斯特氏菌病在人群和动物中暴发流行。己经引起世...

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应 (PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardialamblia)的磷酸丙糖异构酶 (triosephosphateisomerase ,缩写为tim)基因进行特异性扩增 ,结果扩增出 1条 6 83bp的DNA片段。此方法的特异性可高达10 0 % ,而其它DNA样本 ,如日本血吸虫 (Schistosomajaponicum)、刚地弓形虫 (Toxoplasmagondii)、微小隐孢子虫 (Cryptosporidiumparvum)、溶组织内阿米巴 (Entamoebahistolytica)、旋毛虫 (Trichinellaspiralis)和阴道毛滴虫 (Trichomonasvaginalis) ,以及人体血细胞等均未出现扩增反应。本法的敏感性也很高 ,可检测到0 4pg贾第虫包囊的DNA。 13株来自不同地理位置和 或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生 1条长为 6 83bp的目的片段。

二甲亚砜在聚合酶链反应扩增载脂蛋白E基因中的作用

目的 :探讨二甲亚砜 (DMSO)在聚合酶链反应 (PCR)中扩增人类载脂蛋白E基因中的作用 方法 :在不同质量分数DMSO的存在下 ,以PCR技术扩增人类载脂蛋白E基因片段 限制性内切酶酶切检测扩增产物 结果 :在质量分数 5%～ 10 %的DMSO下 ,可以成功地扩增到人类载脂蛋白E基因的第 4外显子片段 结论 :在DMSO作用下 ,PCR扩增增强了特异性

聚合酶链式反应微芯片系统用于微量生物样品的快速扩增检测

基于MEMS微加工技术设计和制作了一种集成微加热器和温度传感器的聚合酶链式反应(PCR)微芯片。PCR微芯片结构通过有限元模拟验证分析。该芯片在PCR扩增过程中具有良好的制热效率和热传递均匀性。在微型温度控制电路装置下进行热循环反应,芯片的温度起伏小于1℃/s,升降温速度分别达到5℃/s和3℃/s,30个热循环耗时30min。此系统已经用于GUS基因的扩增检测,获得了良好的结果,极大的缩短了热循环的时间,可用于微量生物样品的快速扩增检测。