微囊化肝细胞移植治疗暴发性肝衰竭大鼠的疗效观察

目的观察微囊化肝细胞腹腔移植对暴发性肝衰竭大鼠的疗效。方法气流法制备含肝细胞的微囊。D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝功能衰竭模型,设模型组、裸肝细胞腹腔移植组、微囊化肝细胞移植组,每组8只测定ALT、AST、TBil水平。样本比较采用重复测量的多元方差分析或单因素方差分析,组间比较采用t检验。结果肝衰竭模型建立后ALT、AST、TBil迅速升高(P<0.05),并于24h～72h达高峰。同一时间点两两比较发现,Ⅱ、Ⅲ组在48h、72h、120h均明显低于I组(P<0.05),Ⅲ组在48h、72h均低于Ⅱ组(P<0.05)。Ⅲ组峰值较Ⅰ组前移。模型组、裸肝组和微囊组大鼠生存率分别是26.7%(4/15)、40.0%(6/15)、73.3%(11/15),微囊组较模型组、裸肝组大鼠生存率有显著性提高(P<0.05)。结论HCT能降低FHF大鼠ALT、AST和TBil水平,减轻肝损伤程度,可能改善FHF预后。

微囊化肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的研究

目的探讨应用生物微胶囊包裹肝细胞(microencapsulatedhepatocyte)腹腔移植治疗急性肝功能衰竭的机制与可行性,评价生物膜功能。方法D-氨基半乳糖(D-gal)诱发急性肝功能衰竭大鼠模型,造模动物随机分成5组:Ⅰ组生理盐水组;Ⅱ组空微胶囊对照组;Ⅲ组促肝细胞生长素(hepatocytegrowthfactor,HGF)组;Ⅳ组裸肝细胞组;Ⅴ组微囊化肝细胞组,观察造模动物的2周存活率及死亡时间、肝功生化指标的变化,2周后收集腹腔内微胶囊,观察其形态与功能。结果Ⅴ组动物的存活率较Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ组有明显提高(分别为66.7%、33.3%、20%、13.3%、20%,P<0.05),其它组间存活率无显著性差异;Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ组动物的存活时间明显长于Ⅱ组与Ⅰ组(分别为86.0±7.0、84.0±6.0、83.0±6.0、72.0±5.0、65.0±4.0小时,P<0.05);Ⅴ组移植后24小时起白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、凝血酶原时间(PT)较其它组有明显提高(P<0.05)。2周后腹腔收集的空微胶囊形态完整,微囊内肝细胞部分保持存活,Ⅳ组腹腔中大部分游离肝细胞被大网膜包裹破坏。结论微囊化肝细胞移植可以明显提高肝功能衰竭大鼠的存活率,延长生存时间,显著改善肝生化功能。生物微胶囊可以有效阻断免疫排斥反应,保护移植肝细胞,有利于其发挥生物功能。

果糖在微囊化肝细胞制作过程中的细胞保护作用

目的 为了减少肝细胞在微囊化过程中的缺氧损伤， 研究在缺氧状态下果糖对肝细胞的保护作用。方法 将ＳＤ大鼠分为三组：Ａ 组， 细胞分离的灌流液和消化液中均加果糖２０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ，Ｂ、Ｃ两组不加果糖； 细胞分离及微囊化后， 检测细胞的活率； 微囊化肝细胞行体外培养，Ｃ组培养液中加果糖１０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ，Ａ、Ｂ两组不加。测定三组肝细胞的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ） 漏出率（ ％ ） 及培养上清液中的总蛋白质。结果 Ａ组的细胞活率显著高于Ｂ、Ｃ 两组（ Ｐ＜ ０ ．０１） ， 而Ａ 组的ＬＤＨ 漏出率显著低于Ｂ、Ｃ组（ Ｐ＜ ０ ．０１） ，Ａ 组蛋白质合成功能的恢复显著优于Ｂ、Ｃ 组（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。结论 果糖在缺氧状态下能有效延缓肝细胞的缺氧损伤， 但应在缺氧状态发生之前给予才能发挥作用。

长期冻存对微囊化肝细胞形态结构功能的影响及在急性肝功能衰竭中的治疗作用

目的 研究长期液氮冻存对微囊化肝细胞结构和功能的影响。方法 将３ 组 Ｓ Ｄ 大鼠微囊化肝细胞分别用液氮冻存１５ 、３０ 、６０ 天后，检测肝细胞活率、结构、功能及其对急性肝衰的初步治疗效果。结果 冻存后３ 组的细胞活率分别为（７２ ．７５ ±３ ．９） ％ 、（７０ ．０７ ±５ ．６８） ％ 、（７２ ．３９ ±１３ ．７５） ％ ；肝细胞的形态结构正常；肝细胞葡萄糖６磷酸酶、糖原及白蛋白染色正常，培养４ 天后各组的总蛋白和尿素氮的合成分泌功能与新鲜微囊化肝细胞差异无显著性（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。冻存组（１５ 天组） 腹腔移植能明显提高急性肝功能衰竭模型大鼠的存活率５５ ％ （１１／２０） ，与裸细胞组（３３ ％ ，８／２４） 及空囊组（１６ ．６ ％ ，５／３０） 相比差异有显著性（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。结论 液氮可良好的保存微囊化肝细胞的形态结构及功能；冻存微囊化肝细胞腹腔移植有良好的肝功能支持作用。

微囊化肝细胞移植促进急性肝衰竭大鼠肝细胞再生的研究

目的 分析微囊化肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝细胞再生的影响.方法 通过腹腔注射d-氨基半乳糖(d-gal)建立急性肝衰竭大鼠模型,18 h后将造模动物随机分成生理盐水组(Ⅰ)、裸肝细胞移植组(Ⅱ)和微囊化肝细胞移植组(Ⅲ).造模后6、12、24、36、48、72、120、168及240 h时,从各组随机抽取6只大鼠,留下腔静脉血观察肝功能变化,取肝组织用免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(pcna)的表达.另取6只正常大鼠的肝组织作为参考值.结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠10 d生存率分别是26.7%(4/15)、40.0%(6/15)和73.3%(11/15),3组间大鼠生存率差异有统计学意义(x2=9.349,p=0.009).Ⅲ组大鼠生存率较Ⅰ、Ⅱ组有明显提高.造模后6 h,各组大鼠的alt、ast均有所升高,以36～72 h最为明显.Ⅱ、Ⅲ组的alt、ast自36 h开始下降,Ⅲ组的下降较Ⅱ组显著.Ⅰ组造模后tbil逐渐升高,72 h时达最高峰;Ⅱ、Ⅲ组的tbil在48 h时开始下降,其中,在36、48和72 h时Ⅲ组下降较Ⅱ组更为显著.免疫组织化学结果表明,正常组pcna蛋白呈弱阳性或阴性表达,造模后表达量逐渐增多,48 h时达最高峰.其中,Ⅲ组的表达量显著高于Ⅰ、Ⅱ组.结论 微囊化肝细胞移植促进了肝细胞的再生,并可改善急性肝衰竭大鼠的肝功能和预后. abstract： objective to investigate liver regeneration after transplantation of microencapsulated hepatocytes in rats with acute liver failure (alf). methods alf rat model was established by intraperitoneal injection of d-galactosamine (d-galn). after 18 h, rats were randomized into control group ( Ⅰ ), free hepatoeyte transplantation group ( Ⅱ ) and the microencapsulated hepatecyte transplantation group (Ⅲ). six rats for each group were randomly selected and sacrificed at 6, 12, 24, 36, 48, 72, 120, 168 and 240 h after alf induced and blood samples from inferior vena cava were collected. liver functions were tested in blood samples, and the expression of proliferating cell nuclear antigen (pcna) was detected by immunohistochemistry. results ten-day survival rates of 3 groups were 26.7% (4/15), 40.0% (6/15) and 73. 3% (11/15), respectively (x2 = 9. 349,p = 0. 009). survival rate of group Ⅲ was significantly higher than that of group Ⅰ and Ⅱ. levels of alt and ast in each group increased significantly at 6 h after alf induced, and peaked between 48 ～ 72 h. levels of alt and ast in group Ⅱ and Ⅲ declined from 36 h, which was more significant in group Ⅲ. tbil levels in group Ⅰ gradually increased after alf induced and peaked at 72 h. tbil in group Ⅱ and Ⅲ declined from 48 h, which was more markedly in group Ⅲ. in normal rats, the expression of pcna protein was almost negative, but it was strongly expressed in alf rats and peaked at 48 h. the number of positive cells in group Ⅲ was higher than that in group Ⅰ and Ⅱ, and the differences were of statistical signifieance. conclusion the transplantation of microencapsulated hepatocytes can promote the regeneration of liver, and it can improve the liver function and prognosis in rats with alf.

微囊化肝细胞移植对急性肝功能衰竭大鼠Caspase-8及Bid的影响

目前肝细胞移植已成为治疗急性肝功能衰竭的一种新方法。微囊化肝细胞移植因有望解决免疫排斥问题得以重视。凋亡在急性肝功能衰竭发病机制中起重要作用。现已有微囊化肝细胞移植相关研究，但对移植后肝细胞凋亡指标变化的研究较少。本研究旨在通过观察急性肝功能衰竭大鼠微囊化肝细胞移植后Caspase、Bid的变化，及其与肝功能的关系，阐明肝细胞凋亡在急性肝功能衰竭中的作用。

微囊化肝细胞移植对急性肝功能衰竭大鼠血管内皮生长因子表达的影响

目的 动态分析微囊化肝细胞移植对急性肝功能衰竭（ALF）大鼠肝组织中血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响.方法 D-氨基半乳糖诱导建立ALF大鼠模型18 h后,分成ALF模型组、裸肝细胞移植组和微囊化肝细胞移植组各50只大鼠.造模后24、36、48、72、120、168和240 h取各组大鼠肝组织.免疫组织化学法检测VEGF和增殖细胞核抗原（PCNA）表达,半定量RT-PCR检测VEGF mRNA表达.多组样本组间比较采用单因素方差分析.结果 与ALF模型组比较,裸肝细胞移植组和微囊化肝细胞移植组大鼠肝组织中PCNA表达量在36 h开始即显著增高（F=26.26,P〈0.05）.与ALF模型组和裸肝细胞移植组比较,微囊化肝细胞移植组大鼠肝组织中VEGF表达量从36 h开始明显升高（F=25.44,P〈0.05）,且下降也较缓慢,在240 h表达量仍显著高于ALF模型组和裸肝细胞移植组（F=220.25,P〈0.05）.造模24 h,裸肝细胞移植组VEGFmRNA（56.7±9.1）开始高于ALF模型组（48.0±1.9）,差异有统计学意义（F=3.54,P〈0.05）,而微囊化肝细胞移植组（100.7±1.9）在48 h开始显著高于裸肝细胞移植组（94.5±1.4）,差异有统计学意义（F=47.82,P〈0.05）,至240 h时,表达量仍显著高于裸肝细胞移植组,差异有统计学意义（F=21.70,P〈0.05）.结论 微囊化肝细胞移植可增加ALF大鼠肝组织中VEGF的表达,促进肝细胞的再生.

微囊化肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝组织Smac及细胞色素cmRNA表达的影响

目的动态观察微囊化肝细胞腹腔移植对急性肝衰竭大鼠肝组织Smac／DIABLO及细胞色素c（cyt—c）mRNA表达的影响。方法D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭模型，并设微囊化肝细胞移植组、裸肝细胞移植组和对照组。RT—PCR法测定大鼠肝脏凋亡指标Smac／DIABLO和cyt—cmRNA表达情况。样本比较采用重复测量的多元方差分析或单因素方差分析，组间比较采用t检验。结果急性肝衰竭大鼠肝组织中Smac／DIABLO及cyhmRNA的表达较对照组明显增加（F值为4．345、14．821、47．565、42．178、62．961，P值均〈0．05）。裸肝细胞移植组和对照组肝组织中的Smac／DIABLO和cyt—cmRNA表达在48h最高，而微囊化肝细胞移植组的峰值略微前移，在24h最高。结论Smac／DIABLO及cyt—CmRNA的表达随着急性肝衰竭的进程而波动，可以较好地判断肝细胞凋亡情况。

微囊化异种肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭

目的:探讨微囊化猪肝细胞异种移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的可行性.方法:将分离的猪肝细胞微囊化后移植到Wistar大鼠腹腔内,3d后切除大鼠80%肝叶造成肝衰模型,观察大鼠2wk存活情况.结果:对照组、未微囊化肝细胞移植组及微囊化肝细胞移植组的2wk存活率分别为6.2%,31.2%和56.2%,微囊化组肝细胞存活率明显较未微囊化组及对照组高.微囊化肝细胞在移植14d后结构基本完好.结论:微囊化异种肝细胞移植提供了一种治疗急性肝功能衰竭的可行方法.

微囊化猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰的免疫隔离机制

目的:探讨微囊化猪肝细胞腹腔内移植对药物性肝衰大鼠的治疗作用,观察受体存活率、肝组织病理变化及大网膜的免疫隔离作用. 方法:以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)包裹乳猪肝细胞,体外观察APA微囊对NK细胞介导的细胞毒作用的隔离效果.D-氨基半乳糖腹腔内注射诱导大鼠急性肝衰竭,48 h后将微囊化的猪肝细胞移植于大鼠腹腔内,观察移植大鼠存活率,免疫组化法检测大鼠大网膜内CD4、CD8、IgG和IgM的表达. 结果:微囊可有效保护囊内K562细胞不受NK细胞的杀伤.与裸肝细胞移植组相比,微囊化乳猪肝细胞移植组大鼠存活率显著提高(1wk存活率78.6% vs 66.7%, P=0.0 046;2 wk存活率42.9% vs 25.0%,P=0.0027, P<0.01).大网膜CD4、CD8、IgG表达较弱(P=0.0 342、P=0.0 197及P=0.0 445,P<0.05),而IgM表达无明显差异(P>0.05). 结论:APA微囊可有效隔离抗体及淋巴细胞介导的体液和细胞免疫反应.微囊化异种肝细胞移植可治疗大鼠急性肝衰,给予肝功能代谢支持,提高移植治疗效果.

混合细胞共微囊化对肝细胞功能的支持作用

目的观察大鼠肝细胞、转基因肝星状细胞株HGF/CFSC和/或大鼠骨髓来源Thy-1+β2M-细胞(BDTC)共微囊化对肝细胞生物学活性的支持,及腹腔移植混合细胞微囊对急性肝衰竭大鼠肝功能的改善作用.方法利用微囊发生器制备含肝细胞或混合细胞的微囊,依微囊内包裹细胞种类不同,分为微囊化肝细胞组、微囊化肝细胞+CFSC/HGF组)和微囊化肝细胞+CFSC/HGF+BDTC组,通过观察囊内细胞形态和体外培养测定培养液中白蛋白和尿素的分泌,判断各组囊内肝细胞活性和功能的维持;将90%肝大部切除所致的急性肝衰竭大鼠按照移植微囊种类不同分为空囊对照组和上述3个实验组(每组10只),观察腹腔植入后不同时间大鼠的一般状况、存活时间、血生化改变、肝组织再生及微囊化移植物的组织学特征.结果与单独肝细胞微囊者相比,混合细胞微囊内肝细胞存活时间超过1倍,培养液中白蛋白分泌和尿素合成量明显增加(均P<0.01);与对照组相比,微囊化肝细胞或微囊化混合肝细胞移植后,急性肝衰竭大鼠的肝功能显著改善、存活率明显提高(10/10 vs 1/10),其肝组织再生完全;移植21～42 d时,部分微囊附着于肝脏表面并出现血管化,微囊表面存在不同程度的纤维化,微囊内仍有存活的细胞,以微囊化混合肝细胞组优于微囊化肝细胞组.结论混合细胞共微囊化能明显改善囊内肝细胞的存活寿命、形态和功能的维持,微囊化混合肝细胞腹腔移植对促进急性肝衰竭大鼠的肝功能恢复具有显著作用.

睾丸支持细胞与移植

1865年德国人Enricol首先描述了睾丸支持细胞(sertolicell,SC)的结构。尽管发现SC的年代久远,但只是在电镜技术和细胞培养技术问世后,才对其功能有所认识。

Transplantation of microencapsulated umbilical-cord-blood-derived hepatic-like cells for treatment of hepatic failure

AIM: To investigate intraperitoneal transplantation of microencapsulated hepatic-like cells from human umbilical cord blood for treatment of hepatic failure in rats. METHODS: CD34+ cells in umbilical cord blood cells were isolated by magnetic cell sorting. In the in vitro experiment, sorted CD34+ cells were amplified and induced into hepatic-like cells by culturing with a combination of fibroblast growth factor 4 and hepatocyte growth factor. Cultures without growth factor addition served as controls. mRNA and protein levels for hepatic-like cells were analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction, immunohistochemistry and immunofluorescence. In the in vivo experiment, the hepatic-like cells were encapsulated and transplanted into the abdominal cavity of acute hepatic failure (AHF) rats at 48 h after D-galactosamine induction of acute hepatic failure. Transplantation with PBS and unencapsulated hepatic-like cells served as controls. The mortality rate, hepatic pathological changes and serum biochemical indexes were determined. The morphology and structure of microcapsules in the greater omentum were observed. RESULTS: Human albumin, alpha-fetoprotein and GATA-4 mRNA and albumin protein positive cells were found among cultured cells after 16 d. Albumin level in culture medium was significantly increased after culturing with growth factors in comparison with culturing without growth factor addition (P < 0.01). Compared with the unencapsulated group, the mortality rate of the encapsulated hepatic-like cell-transplanted group was significantly lower (P < 0.05). Serum biochemical parameters, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and total bilirubin in the encapsulated group were significantly improvement compared with the PBS control group (P < 0.01). Pathological staining further supported these findings. At 1-2 wk post-transplantation, free microcapsules with a round clear structure and a smooth surface were observed in peritoneal lavage fluid, surviving cells inside microcapsules were found by trypan blue staining, but some fibrous tissue around microcapsules was also detected in the greater omentum of encapsulated group by hematoxylin and eosin staining. CONCLUSION: Transplantation of microencapsulated hepatic-like cells derived from umbilical cord blood cells could preliminarily alleviate the symptoms of AHF rats.

S期激酶相关蛋白2在急性肝功能衰竭大鼠肝组织中的表达

目的探讨急性肝功能衰竭（ALF）大鼠S期激酶相关蛋白2（Skp2）表达变化及意义。方法雄性SD大鼠256只，其中240只用D-氨基半乳糖溶液制备ALF模型，将大鼠分为ALF模型组、裸肝细胞移植组和微囊化肝细胞移植组，经腹腔分别注射RPMI1640培养液、裸肝细胞悬液、微囊化肝细胞悬液各2mL。另外6只作为健康对照组，另10只用于肝细胞分离。免疫组织化学法检测不同时间点大鼠肝细胞中Skp2蛋白的表达，全自动生化分析仪测定各组ALT、AST、TBil值，并观察各组生存率，多组样本问比较采用单因素方差分析。结果微囊化肝细胞腹腔移植可较裸肝细胞更好地降低ALF大鼠ALT、AST、TBil水平（P〈0．05）。造模36h时，ALF模型组、裸肝细胞移植组和微囊化肝细胞移植组肝中Skp2-标记指数分别为（28．2±6．1）％、（41．4±10．5）％和（68．0±10．8）％（F=29．08，P〈0．05），三组各15只大鼠168h时各有4、6和11只存活。结论动态观察Skp2表达可较好地判断ALF肝细胞的再生情况。