微囊藻毒素亮氨酸精氨酸(MC-LR)损伤睾丸支持细胞免疫反应及细胞生物学行为的机制研究进展

微囊藻毒素亮氨酸精氨酸(MC-LR)是水华爆发时微囊藻属、鱼腥藻属等蓝藻产生的一种对人类有致癌性的藻毒素。MC-LR可对雄性动物生殖系统产生毒性,导致不育,主要表现为诱导细胞凋亡、破坏细胞骨架、干扰DNA损伤修复途径或损伤血睾屏障(BTB)功能等。睾丸支持细胞(Sertoli细胞)是生精小管中与生精细胞直接接触的体细胞,可通过分泌多种细胞因子和免疫抑制因子调节免疫反应以维持睾丸免疫稳态,亦可与邻近生殖细胞形成BTB,为各级生精细胞提供营养、支持和保护作用的微环境。MC-LR可引发睾丸Sertoli细胞炎症、诱导细胞凋亡、破坏BTB完整性,进而造成睾丸生精功能障碍。

液相色谱串联三重四级杆质谱法测定水中微囊藻毒素LR

目的:对液相色谱串联三重四级杆质谱法测定水中微囊藻毒素LR的测量结果 进行不确定度评定。方法:依据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》,找出测定过程中不确定度来源,得出测量结果的扩展不确定度。结果:当微囊藻毒素LR检测结果为4.80μg/L时,扩展不确定度U=0.29μg/L(k=2)。结论:本方法适用于液相色谱串联三重四级杆质谱法测定水中微囊藻毒素LR含量的不确定度分析与评定。

基于磁珠和时间分辨荧光免疫分析的微囊藻毒素LR单链抗体筛选与鉴定

【目的】从鼠源合成噬菌体抗体库中,快速分离获得微囊藻毒素LR单链抗体。【方法】采用磁珠筛选和负筛选方法,设计两轮微囊藻毒素LR单链抗体的筛选方案。用噬菌体产出投入比和多克隆噬菌体免疫分析,对每轮筛选后微囊藻毒素LR特异性噬菌体的富集效果进行鉴定。再将第2轮筛选获得的次级库提取单链抗体基因,转入可溶性表达载体;诱导表达后,采用时间分辨荧光免疫法,对单个噬菌体克隆鉴定并测序。【结果】两轮筛选的噬菌体产出投入比分别为4.8×10-8和2.88×10-6。第2轮筛选后的次级库,经多克隆噬菌体免疫分析得到的荧光信噪比,比原始抗体库提高了22.8倍。最终鉴定得到5株不同的阳性噬菌体克隆,其中最佳的克隆对微囊藻毒素LR的检测灵敏度(IC10)为13 ng.mL-1,抑制中浓度(IC50)为435 ng.mL-1,线性范围在31—5 952 ng.mL-1。【结论】本研究筛选到的单链抗体,有潜力应用于微囊藻毒素LR的免疫学检测或免疫亲和柱的制备,同时也探索了一种高效的微囊藻毒素LR单链抗体的库筛选、鉴定方法。

微囊藻毒素LR在动物体内整体水平及细胞水平的分布

目的 研究和探讨微囊藻毒素LR(MicrocystinsLR ,MCLR)在机体内分布的靶器官及其在靶器官中的细胞水平定位。方法 用1 2 5I MCLR标记物纯化 ,并注入小鼠体内 ,分别经同位素示踪技术和放射性自显影方法研究1 2 5I MCLR在小鼠体内整体水平和细胞水平的分布。结果 同位素示踪显示 ,静脉注射、腹腔注射和口服 3种不同途径进入体内的1 2 5I MCLR ,70 %以上分布在肝脏和肾脏 ;提示这两个脏器是它的靶器官。放射性自显影研究表明 ,1 2 5I MCLR在靶器官肝脏和肾脏内分别定位于肝细胞核内和肾皮质的肾细胞核内。结论 该研究结果将为进一步探讨MCLR的损伤机制提供理论依据。

微囊藻毒素LR对BRL-3A凋亡相关蛋白表达的影响

用蛋白印迹法研究了微囊藻毒素LR(MCLR)暴露时大鼠BRL-3A细胞p53、Bcl-2和Bax的表达情况.结果表明,与对照组相比,各实验组p53和Bax表达均明显升高.除了10nmol/L LR暴露1h实验组外,其它实验组Bcl-2表达均下降.在低浓度组(10nmol/L),随暴露时间的延长,p53和Bax表达逐渐升高,Bcl-2表达逐渐下降,而在中浓度(100nmol/L)和高浓度组(1000nmol/L),蛋白表达与暴露时间的一致性没有低浓度组(10nmol/L)明显.表明p53、Bcl-2和Bax在MCLR诱导的细胞凋亡中可能起重要作用.

多孔分子印迹膜修饰的表面等离子体共振微囊藻毒素LR检测传感器

开发了一种多孔分子印迹膜修饰的表面等离子体共振（SPR）传感器,用于快速检测水中微囊藻毒素LR。研究了利用该传感器检测微囊藻毒素LR的方法。首先,通过原位聚合法在SPR传感芯片的裸金表面合成了微囊藻毒素LR的多孔分子印迹膜,制备出可以特异性捕获微囊藻毒素LR的SPR传感芯片。然后,利用Kretschmann棱镜耦合结构,构建了基于Kretschmann结构的波长调制型表面等离子体共振传感器。最后,通过检测不同浓度的微囊藻毒素LR溶液以及干扰物质微囊藻毒素RR溶液,研究了该传感器的测量范围、特异性等参数。结果表明,该传感器对于微囊藻毒素LR的检测灵敏度很高,可实现微囊藻毒素LR的定量检测,动态测量达2.1×10^-9~1×10^-6 mol/L。另外,传感器对于干扰物质微囊藻毒素RR无明显信号响应,表明传感器对于微囊藻毒素LR具有很好的特异性检测能力。

超高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱法快速分析水中微囊藻毒素LR

建立超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱快速测定水中微囊藻毒素LR（MC-LR）的方法。水样经0.2μmGHP一次性针头过滤器过滤,应用超高效液相色谱/电喷雾串联四极杆质谱仪多离子反应监测（MRM）法定量检测MC-LR。经方法学验证,该方法对MC-LR的最低检出限LOD为0.08μg/L（进样量10μl）,最低定量限LOQ是0.10μg/L。在0.2-20.0μg/L的线性范围中,相关系数r=0.9982,回收率范围91.5%-110.3%。方法灵敏度高,专属性强,操作简便快速,定量准确,测定浓度范围宽,是环境水质样品中MC-LR含量检测的理想方法。

微囊藻毒素LR影响人肝细胞HL7702的ERK及JNK的蛋白磷酸化

微囊藻毒素（Microcystin,MCYST）是蓝藻的一些属产生的次级代谢产物,在发生水华的水体中普遍存在。微囊藻毒素LR（MCLR）是微囊藻毒素中存在最为普遍且毒性作用最强的一种。已有研究表明,微囊藻毒素可以诱发肝毒性并且与人群中的肝癌发生密切相关[1,2],因此进一步阐明其致毒机理具有重要的意义。

绿茶对微囊藻毒素LR诱导肝细胞凋亡、Bcl_2表达及骨髓嗜多染红细胞微核的影响

背景与目的:研究绿茶(greentea,GT)对微囊藻毒素LR(MC-LR)诱导肝细胞凋亡、Bcl-2蛋白表达及微核发生的影响以探讨毒性拮抗机制。材料与方法:雄性小鼠50只随机分为5组,分别为空白对照、MC-LR染毒组、GT高低剂量拮抗组和环磷酰胺对照组。实验第1d起GT高、低剂量拮抗组小鼠每日分别给予12g/L和2g/L两种浓度的GT自由饮用,连续18d。自第6d开始,染毒小鼠每日给予MC-LR10μg/kg腹腔注射1次,空白对照给予DMSO腹腔注射,连续13d。环磷酰胺对照组以50mg/kg剂量间隔24h两次给药后6h取材。小鼠处死后采用免疫组化和计数法对肝细胞凋亡、Bcl-2蛋白表达以及骨髓嗜多染红细胞(PCEs)微核发生率进行检测和分析。结果:(1)MC-LR染毒明显诱导小鼠肝细胞凋亡增加。高剂量GT处理后明显抑制MC-LR染毒所致小鼠肝细胞凋亡的发生(P<0.05);(2)单纯MC-LR染毒肝细胞Bcl-2表达未见明显变化,GT各剂量组小鼠肝脏Bcl-2的表达明显增加,与MC-LR染毒组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。(3)GT拮抗组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率(PCEs-MN)与MC-LR染毒对照和空白对照相比,其差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:GT能上调抑癌基因Bcl-2的表达,抑制细胞凋亡。MC-LR染毒及GT拮抗对微核发生均未有显著影响。

微囊藻毒素LR对大鼠卵巢颗粒细胞氧化损伤和凋亡的影响

目的:研究微囊藻毒素LR(MC-LR)对大鼠卵巢颗粒细胞的氧化损伤和致凋亡作用。方法:分别以10、20、30μg/mL的MC-LR对体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞染毒48 h,测定细胞内活性氧(ROS)含量、细胞培养液超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、卵巢颗粒细胞凋亡率和凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达水平。结果:与对照组比较,随着MCLR剂量升高,染毒组细胞内ROS升高(r=0.925,<0.01);细胞培养液中T-SOD活性降低(=-0.865,P<0.05);MDA含量升高s s(r=0.811,P<0.01)。卵巢颗粒细胞凋亡率随MC-LR剂量的升高而升高(P<0.05);凋亡相关基因Bax mRNA的表达量随MC-LR剂量的s升高而升高(r=0.972,P<0.01),但Bcl-2 mRNA的表达量随MC-LR剂量的升高而降低(r=-0.972,P<0.01)。结论:MC-LR对大鼠卵s s巢颗粒细胞具有氧化损伤作用,并能引起卵巢颗粒细胞凋亡和凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA表达的改变。

微囊藻毒素LR对SD孕鼠胎盘的损伤作用研究

目的 探讨微囊藻毒素LR(MicrocystinsLR ,MCLR)对SD孕鼠胎盘的损伤作用。方法 采用整体动物模型观察器官形成期暴露给MCLR对大鼠胎盘的损伤和对宫内胚胎发育的影响。结果 不同剂量的MCLR均可损伤胎盘屏障 ,在停止注射 6天后 ,仍可造成整个胎盘细胞变性、水肿和间质疏松。结论 MCLR可直接对胎盘产生毒性作用 ,损伤胎盘屏障并改变其通透性 ,使得MCLR容易进入胎盘而影响胚胎形成和发育。

饮用水源区水中微囊藻毒素—LR检测——以四川省成都市百工堰水库为例

应用高效液相色谱法对四川省成都市饮用水源区——百工堰水库水样中的微囊藻毒素—LR进行检测。结果表明,水样中微囊藻毒素—LR的含量低于国家生活饮用水卫生标准(GB5749—2006)规定值。同时,对饮用水源水样水质的主要指标进行了测定,并探讨了微囊藻毒素—LR检测结果与水质监测结果的相关性。

微囊藻毒素LR抑制小鼠淋巴细胞免疫功能的体外研究

目的：探讨微囊藻毒素LR（microcystin LR,MC-LR）抑制小鼠淋巴细胞免疫功能的可能机制。方法：分离小鼠脾淋巴细胞,分别用含MC-LR为0、1、3、5、10μg/ml的培养液,染毒脾淋巴细胞,MTT法检测MC-LR对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响;ELISA法测定淋巴细胞IL-2的含量;FCM法检测淋巴细胞凋亡率。结果：各MC-LR剂量组淋巴细胞的增殖指数均下降;1μg/mlMC-LR刺激淋巴细胞分泌IL-2,而5、10μg/mlMC-LR组却抑制淋巴细胞分泌IL-2;10μg/mlMC-LR组淋巴细胞凋亡率明显升高（P均〈0.05）。结论：体外培养条件下,MC-LR能明显抑制小鼠脾淋巴细胞增殖,降低淋巴细胞因子IL-2的含量并诱导淋巴细胞凋亡。

铜绿微囊藻细胞培养与藻毒素LR提取的研究

铜绿微囊藻菌ＣＣＡＰ１４５０／４在室内人工培养的结果表明，较大的无机培养液表面、连续适当光照２０ｕＥ／（ｍ２·ｓ）及适宜的温度（２５℃）有利于该藻菌的生产．通过超声波击碎细胞，离心过滤Ｃ１８净化柱分离，得到藻毒素．应用高效液相色谱分离主峰纯化藻毒素藻毒素在紫外光谱２３８ｎｍ处出现吸收高峰表明，铜绿微囊藻菌ＣＣＡＰ１４５０／４中藻毒素的主要成分是藻毒素ＬＲ．本研究还探索了简便、快速人工培养铜绿微囊藻菌及高效、叶靠分离纯化藻毒素ＬＲ的方法．

铜绿微囊藻中微囊藻毒素LR的UPLC-MS/MS法分析

为了实现对微囊藻细胞中微囊藻毒素LR(Microcystin LR)的准确定量,建立了铜绿微囊藻中微囊藻毒素LR的超高效液相色谱三重四级杆质谱联用(UPLC-MS/MS)分析方法。将铜绿微囊藻干藻粉复溶在50 m L 0.1%三氟乙酸水溶液中,-55℃/37℃反复冻融3次,HLB固相萃取小柱浓缩和净化。采用ACQUITY UPLC CSH^(TM)C_(18)色谱柱,以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈为流动相,梯度洗脱分离,UPLC-MS/MS外标法定量分析。微囊藻毒素LR在5 ng/m L^150 ng/m L范围内线性良好,相关系数大于0.995,方法检出限为0.28 ng/m L,加标回收率在98.5%~104%,日内重复性和日间重复性分别为3.5%和5.6%(n=6)。该方法操作简便,重复性好,对微囊藻细胞中微囊藻毒素MC-LR的定量准确可靠。

铜绿微囊藻毒素LR提取的研究

铜绿微囊藻 (Microcystisaeruginosa)CCAP1450 / 4在室内人工培养。结果表明在较大培养液表面、连续适当光照 ( 2 0 μE- 2 S- 1)及适宜的温度 ( 2 5℃ )有利于该藻菌的生产。通过超声波击碎细胞 ,离心过滤 ,C18净化柱分离 ,得到铜绿微囊藻毒素。应用高效液相色谱分离主峰得到纯化铜绿微囊藻毒素LR ,该毒素LR在紫外光谱分析中 ,2 38nm处出现吸收高峰。研究表明 ,铜绿微囊藻菌CCAP1450 / 4中铜绿微囊藻毒素的主要成份是铜绿微囊藻毒素LR。本研究探索了简便、快速人工培养铜绿微囊藻菌及高效、可靠分离纯化铜绿微囊藻毒素LR的方法。

微囊藻毒素LR免疫原及包被抗原的合成与鉴定

微囊藻毒素LR(MC-LR)分子量小于1000u,为半抗原,需要与载体蛋白偶联后才能刺激免疫应答用于抗体制备。本研究利用碳二亚胺法将MC-LR分别与钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,获得免疫抗原(MC-KLH)和包被抗原(MC-BSA)。采用紫外扫描光谱、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)等3种方法对2种人工抗原进行鉴定,并对小鼠进行免疫。用间接非竞争酶联免疫吸附测定法(ELISA)和竞争ELISA测定了抗血清效价和敏感度。结果表明,紫外扫描光谱法可观察到2种人工抗原的紫外吸收谱与载体蛋白相比发生改变。通过SDS-PAGE法可以观察到MC-BSA分子量比BSA增大。另外质谱法测定的MC-BSA的相对分子量为76515.84,计算得到的MC-LR与BSA的偶联比为10∶1。MC-KLH免疫小鼠后,抗血清效价最高达到1∶32000倍,MC-LR对鼠多抗血清的抑制中浓度(I50)为0.53μg/mL。成功合成了MC-LR的免疫原和包被原为其单克隆抗体的制备奠定了基础。还比较了3种鉴定方法的适用性和优缺点,为其他人工抗原的鉴定方法提供了有益的参考。

LR型微囊藻毒素对鲢鱼PEPCK基因表达的影响

在前期经LR型微囊藻毒素(MC-LR)处理后建立鲢鱼肝脏组织抑制差减杂交文库的基础上,利用RACE方法克隆了经MC-LR处理后差异表达明显的鲢鱼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因cDNA全长,并对其进行了序列分析,然后通过半定量分析了经MC-LR投与1、5、10 h鲢鱼肝脏组织PEPCK表达水平。结果显示:鲢鱼PEPCK基因cDNA全长2 605 bp,包括101 bp的5'端非翻译区、564 bp的3'端非翻译区、1 911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸。将鲢鱼PEPCK基因cDNA核酸及氨基酸序列与GenBank中已发表的其他几种鱼类的相应序列进行比对,表明鲢鱼PEPCK与翘嘴红鲌的同源性最高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到97%和99%;其次为斑马鱼,同源性均达到90%以上;与星斑川鲽的同源性最差,但核酸及氨基酸序列的相似性也分别达到77%和84%,说明鱼类PEPCK在长期的进化过程中具有很高的保守性。鲢鱼PEPCK具有与草酰乙酯结合的特有结构域以及与GTP三磷酸链结合的激酶1和激酶2基序。另外,鲢鱼投予MC-LR后,肝脏组织PEPCK经过1、5、10 h的表达量均有显著升高,说明鲢鱼投予MC-LR 1 h内该基因即被诱导表达,且在10 h内皆维持较高的表达水平。这与微囊藻毒素作用有关,推测与微囊藻毒素解毒过程相关。