DNA条形码识别 Ⅵ：基于微型DNA条形码的果实蝇物种鉴定

选用双翅目实蝇科12属36种55个样本为材料,将其DNA条形码(mtDNACOI基因648bp)与微型DNA条形码(mtDNACOI基因50～200bp)数据进行比较分析,探讨微型DNA条形码对果实蝇物种鉴定的可行性.采用虚拟实验(Silico analysis),将BOLD数据库中49个样本的序列分别拆成648bp、160bp、50bp三个片段,通过构建NJ树,并进行遗传距离分析,得出每个片段鉴定物种的准确性依次为100%、94%、84%.同时做了实体实验(Empirical test),得到了果实蝇属6个物种的COI序列,将其与虚拟实验中的49个样本序列合并,以DNA-barcode指定序列5’端160bp序列为分析基础,通过遗传距离分析,得出其鉴定物种的准确性为94%,验证了虚拟实验结果.即微型DNA条形码(Minimalistbarcode)鉴定果实蝇物种的准确性与DNA条形码基本一致,均可作为果实蝇物种鉴定的有效依据.

基于微型DNA条形码的多种动物源性成分的鉴定

通过分析51种动物的DNA条形码序列,新设计一对微型DNA条形码的通用引物,建立一种联合微型DNA条形码和克隆测序法对动物源性多组分样品进行准确、高效鉴定的方法。用微型DNA条形码分别鉴定11种常见食用肉类,判断其对物种鉴定的准确性,并比较其与标准DNA条形码对物种的鉴定效果,然后将11种常见商品肉类等比例混合,探究克隆测序法对混合肉样品的鉴定效果。结果表明:引物有较好的通用性,能对具有不同的引物同源性水平的11个物种进行有效扩增并获单一条带。微型条形码能准确鉴定11个肉类物种,与常规DNA条形码鉴定效果一致。经克隆测序法,把混合样品的9个物种一并检出,总体上达到了较高的检出效率,同时深入讨论了未能检出全部物种的原因。微型条形码良好的物种鉴定能力的研究结果为联合微型DNA条形码与二代测序技术进行混合样品中物种的高效鉴定提供参考依据。

微型DNA条形码在水产类物种掺假检测中的应用

水产类物种掺假导致了商业欺诈、食品安全等问题,建立一种快速高效的水产类物种掺假检测技术迫在眉睫。目前,标准DNA条形码(FDB)在水产类物种掺假检测中已经得到了广泛应用,但是食品加工中的高温、高压、反复冻融和酸碱变化等因素均会使DNA发生降解,导致标准DNA条形码扩增失败。微型DNA条形码(MDB)可以利用相对较短(<350 bp)的标准DNA片段对深加工水产品进行物种鉴定,对水产品物种掺假检测具有重要意义。本文首先举例说明了世界各国水产品掺假现状,然后介绍了FDB检测技术及其在实际应用中存在的问题,最后总结了微型DNA条形码技术在水产类物种掺假检测中的应用,并对微型DNA条形码的片段长度选择以及目的基因筛选进行了初步探讨。

微型DNA条形码在鱼类物种鉴定中的适用性研究

以台湾海峡11目38科66属85种355个鱼类样品为研究对象,选取线粒体COⅠ基因中长为313 bp的序列为微型条形码,探讨微型DNA条形码技术在鱼类分类鉴定中的适用性。共获取355条基因序列,序列中T、C、A、G碱基的平均含量占比分别为29.50%、30.10%、24.90%和15.50%;AT含量占比均高于50%。样品种内、种间、属间、科间和目间的K2P(Kimrua-2-Parameter)遗传距离分别为0.37%、18.10%、22.10%、25.40%和27.80%,遗传距离随着分类阶元的提高而增大,种间遗传距离是种内遗传距离的49倍,表明该微型DNA条形码可用于鱼类的分类鉴定,可有助于渔业资源调查和生物多样性保护。

基于微型DNA条形码的黄粉蝶亚科的物种鉴定

选用黄粉蝶亚科6属38种38个样本为实验材料,采用虚拟实验(Silico analysis),从BOLD数据库中取得36个样本的序列,同时做实体实验(Empirical test),得到剩余2个样本的COI序列,将所有样本的序列分别拆成648bp、200bp、50bp 3个片段,运用MEGA7.0软件构建NJ树(Neighbor-Joining,Saitou&Nei,1987),并计算出变异位点、简约位点、种内差异和种间差异;对DNA条形码(DNA Barcode)与微型DNA条形码(Minimalist-barcode)进行比较,找出各自的优缺点并探求微型DNA条形码对黄粉蝶亚科鉴定的可行性。结果表明,在鉴定黄粉蝶亚科的准确性方面,微型DNA条形码与DNA条形码基本相同,均可作为黄粉蝶亚科物种鉴定的有效依据。

药用蛇及其水提物的DNA微型条形码鉴别研究

目的:建立药用蛇及其水提物的DNA微型条形码鉴别方法。方法:通过比对药用蛇及常见11种混伪品的16S rRNA序列,建立约220 bp的蛇类DNA微型条形码,并与16S rRNA标准条形码比较,对药用蛇原料及水提物进行测序鉴定。采用MEGA-X软件分析遗传距离并以邻接法(NJ)构建系统发育树。结果:DNA微型条形码引物对药用蛇原料及水提物的扩增率为100%,鉴定率为100%。药用蛇及其混伪品的种内平均遗传距离均小于种间平均遗传距离,且各物种在NJ系统发育树中具有良好的单系性,并与16S rRNA标准条形码原料的鉴定结果一致。结论:该研究建立的蛇类DNA微型条形码可有效实现药用蛇原料及水提物等制品的物种鉴别,为保障蛇类原料、临床汤剂及配方颗粒等药品的安全性和有效性提供了技术支撑。

基于微型DNA条形码技术的鱼胶基原鱼种鉴定研究

本文以线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(Cytochrome OxidaseⅠ,COⅠ)基因为目标基因,采用微型DNA条形码技术对鱼胶样品进行基原鱼种鉴定,分析微型DNA条形码技术在鱼胶基原鱼种溯源及鉴定中的可行性,并对我国鱼胶产品标签符合性情况进行调查。结果显示:在150份鱼胶样品中共鉴定出12科24种鱼类,以石首鱼科种类最多。对市售具有明确商品名称的71份鱼胶干品和20份即食鱼胶进行检测,发现商品名称与基原鱼种对应关系混乱、商品标签上无明确鱼种种类标识等现象。鱼胶产品基原鱼种鉴定技术的开发对预防和消除商业中的欺骗行为,以及促进我国鱼胶进出口贸易的稳定发展具有重要意义。

近年来DNA微型条形码和DNA宏条形码在中药鉴定中的应用

中药鉴定是保证中药有效性和安全性的重要一环。DNA条形码技术让中药鉴定摆脱了经验依赖,弥补了传统化学方法和形态学方法鉴定中药材的不足,然而对于在炮制或加工过程中DNA降解的药材和复杂样品方面鉴定能力有限。中药DNA条形码鉴定技术近年来发展迅速,DNA微型条形码的出现,不仅可用于鉴定DNA发生严重降解的实验材料,在很大程度上弥补了传统条形码的短板,还可作为候选条形码,与标准条形码组合,共同鉴定混合中药材样本。此外,DNA宏条形码技术通过将DNA条形码与高通量测序技术相结合,以实现组合样本中多个物种的检测,是目前混合中药材鉴定方面最有效的分子鉴定方法。该文通过对近年来DNA微型条形码、DNA宏条形码在有关中药物种及中药共存微生物组成鉴定的研究进行梳理总结,以明晰该领域研究现状,并展望未来发展,为中药分子鉴定研究提供参考。

炮山甲及其混伪品的DNA微型条形码鉴定研究

目的:建立基于DNA微型条形码的炮山甲及其混伪品的分子鉴定技术。方法:采用改良的DNA提取方法提取中华穿山甲与其易混物种炮制甲片的DNA,利用线粒体COⅠ、16S rRNA和12S rRNA基因的标准及微型条形码引物进行PCR。双向测序后进行BLAST和序列位点分析,再计算种内和种间K2P遗传距离,并构建NJ系统树。结果:16S rRNA(L2513/H2714)和12S rRNA(L1085/H1259)引物对在所有甲片DNA中均能扩增成功,所获序列与Genbank序列的BLAST比对相似度大于98%。中华穿山甲与其易混物种的种间遗传距离远大于其种内遗传距离,而且各物种在NJ树中表现出单系性,其中16S rRNA微型条形码能将穿山甲属聚在一起。结论:基于16S rRNA的微型条形码技术可有效鉴别炮山甲及其混伪品。

中国大陆近海菖鲉属鱼类新记录种——三色菖鲉(Sebastiscus tertius)的形态特征与DNA条形码研究

2018年4月在浙江省舟山近海海域的渔业资源调查中采集到19尾菖鲉属鱼类标本,经鉴定发现为三色菖鲉(Sebastiscus tertius),为中国大陆近海海域的新记录种。本研究对采集到的19尾三色菖鲉标本拍摄照片并对其进行形态特征以及DNA条形码研究。三色菖鲉具有以下主要形态特征:背鳍数ⅩⅡ-12,胸鳍数18—19,腹鳍数Ⅰ-5,臀鳍数Ⅲ-5;第一鳃弓总鳃耙数6—7+13—17;前鳃盖骨有5枚硬棘,鳃盖骨后沿有2枚硬棘;眶前骨下后角有1枚硬棘;胸鳍处有一明显黑斑。测定了19尾标本的12S rRNA和COI序列,结合GenBank中所有学名为Sebastiscus tertius的同源序列进行分析,发现12S rRNA序列完全一致,可作为该物种的微型DNA条形码,而COI序列中所有个体明显分为两个分支,两者遗传距离达到0.044,表明两分支可能为不同的有效种。COI同源序列分析结果显示,GenBank中学名为Sebastiscus tertius的鱼种与褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)聚为一支,表明GenBank中的Sebastiscus tertius存在错误鉴定的情况。