微小牛蜱铁蛋白编码基因的克隆和分析

从微小牛蜱克隆到1个新的铁蛋白编码基因,cDNA全长642bp,编码区为123 639bp,编码172个氨基酸残基,该蛋白预测的分子量为19 9ku,等电点为4 24。经过分析,其预测氨基酸序列与已报道的变异革蜱、非洲钝缘蜱和蓖子硬蜱铁蛋白同源性分别为93 60%、88 37%和83 72%。且核苷酸序列在mRNA5′未翻译区(5′UTR)的茎环结构存在铁应答元件(IRE),其氨基酸序列上带有典型的亚铁氧化酶中心结构的保守序列。RT PCR分析表明,该基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半饱血雌蜱、饱血雌蜱和雄蜱这几个阶段均有表达。

福建厦门微小牛蜱中埃立克体的检测与鉴定

目的检测福建厦门微小牛蜱携带的埃立克体,进行分类鉴定。方法采用套式PCR方法检测埃立克体,然后对阳性标本中的埃立克体进行16S rRNA全基因序列测定并分析。结果共检测吸血微小牛蜱标本299份,27份阳性,阳性率为9.0%。选择其中的1份阳性样本扩增16S rRNA的全基因序列,全长1458bp,序列对比显示与泰缅边境和越南的埃立克体同源性为99.9%,相差2个碱基;与西藏埃立克体同源性为99.7%,相差4个碱基;与非洲埃立克体同源性为99.6%,相差7个碱基;与中国南方的查菲埃立克体同源性为98.9%,相差17个碱基。结论从福建厦门微小牛蜱中检测到埃立克体,可能是一个埃立克体新的亚种。

微小牛蜱Bm86基因的克隆与原核表达

根据已发表的Bm86基因序列,设计表达型引物,利用RT-PCR技术,从微小牛蜱饥饿幼蜱的研磨物中扩增Bm86基因,将PCR产物连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86.测序分析表明:克隆的微小牛蜱Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97%和95.6%.然后对重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86进行双酶切,获得带有粘性末端的Bm86基因片段,并将此片段定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Bm86,将其转化到BL21宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测表明表达产物为分子量为88 Ku的融合蛋白,目的蛋白约占蛋白总量的39%,表达量约为1.08 mg/mL.Western blot分析表明此表达产物能被兔抗微小牛蜱阳性血清所识别.

七种药物对微小牛蜱的半数致死浓度测定

用浸渍法测定了楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、哒嗪酮、螨净 7种药物对未吸血的微小牛蜱 (Boophilusmicroplus)幼蜱、若蜱、成蜱及其饱血雌蜱的半数致死浓度(LC50 )。结果显示 ,所用药物中半数致死浓度最低的 3种药物是楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤。植物性杀虫剂楝素对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为3.0 1～ 3.13、4 .37～ 4 .77、11.18～ 11.36、2 75 .5 0～ 2 76 .5 0mg/L ;植物性杀虫剂苦皮藤对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 4 .2 2～ 4 .4 2、10 .30～ 10 .5 0、82 .5 0～82 .70、6 35 .30～ 6 36 .70mg/L ;人工合成的除虫菊酯类的三氟氯氰菊酯对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 3.4 2～ 3.4 4、7.10～ 9.0 6、4 2 .30～ 4 2 .5 0、5 45 .5 0～5 46 .70mg/L。

微小牛蜱Bm86基因的原核表达与表达条件的优化

根据微小牛蜱Bm86基因序列设计引物,在重组质粒pMD18-T-Bm86中克隆,并将其定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同时间进行诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,37℃条件下经1mmol/LIPTG诱导8h后,目的重组蛋白表达量最大,表达相对分子质量(Mr)约为94000的包涵体蛋白,与预期大小一致,目的蛋白约占蛋白总量的29%。蛋白质印迹(Western blotting)分析表明,该重组蛋白可被兔抗微小牛蜱全蜱阳性血清所识别。

微小牛蜱Bm86基因的真核表达

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68 ku重组Bm86蛋白,目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32%以上,诱导96 h目的蛋白的表达量为0.36 mg/mL。

一株白僵菌的分离鉴定及其对微小牛蜱的致病力试验

为了得到用于防控微小牛蜱的高毒力菌株,本试验从野外微小牛蜱饱血雌蜱体表分离出一株白僵菌,通过形态学和分子生物学方法进行了鉴定,确认该分离株为球孢白僵菌。致病力研究表明,当孢子浓度达到108孢子/mL,该菌株对微小牛蜱饱血成蜱的致死率即可达到100%,为微小牛蜱的生物防控试剂的研究及应用奠定了基础。

微小牛蜱一个抗菌多肽编码基因的克隆和表达

为了进行抗蜱及蜱传病疫苗的研究 ,本研究根据微小牛蜱巴西株报道的一种抗菌多肽核苷酸序列设计引物 ,从微小牛蜱中国安徽株克隆到该抗菌多肽基因 ,全长 383bp ,编码 110个氨基酸残基 ,该蛋白预测的分子量为 12 2ku ,等电点为 4 87。经同源性比较 ,该微小牛蜱巴西株抗菌多肽基因有 10 0 %的相同性。经RT_PCR分析表明 ,该基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半饱血雌蜱、饱血雌蜱和雄蜱这几个阶段均有表达。将该基因亚克隆到 pET_2 8a(+)表达载体 ,转化BL2 1(DE3)宿主菌 ,经IPTG诱导 ,可成功表达。重组融合蛋白大小为 15ku左右 ,与预期大小一致。初步体外抗菌试验表明 ,重组蛋白具有一定的抗菌活性。Western_blot显示 。

微小牛蜱Bm91基因的原核表达

根据GenBank收录的微小牛蜱Bm91基因序列设计一对表达引物,以微小牛蜱幼蜱总RNA反转录合成的cDNA为模板,扩增获得了Bm91基因,其长度为1 908 bp,包含一个大小为1 833 bp的完整开放阅读框,编码611个氨基酸,该蛋白预期分子质量为83 ku。将Bm91基因片段亚克隆到原核表达载体pET-30a,构建重组原核表达载体pET-30a-Bm91,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,发现在0.8 mmol/LIPTG,诱导时间2 h,温度37℃条件下,目的重组蛋白表达量最大,约占蛋白总量的20%。SDS-PAGE检测表明,表达产物为分子质量为83 ku的融合蛋白,与预期大小一致;Western blot分析表明,表达产物能被兔抗微小牛蜱阳性血清所识别。

新疆南疆地区微小牛蜱Bm86基因克隆及鉴定

为了克隆及鉴定新疆南疆地区微小牛蜱Bm86基因,参照Gen Bank登录的微小牛蜱Bm86基因序列,设计了可以扩增Bm86基因完整阅读框架的引物,对微小牛蜱进行总RNA提取、RT-PCR、克隆、测序、序列分析。结果表明,获得的Bm86基因长1 953 bp,与Gen Bank中登录号为M29321、HQ014398的微小牛蜱Bm86基因核苷酸同源性分别为99%、97%,且为一个完整的开放阅读框架。本研究获得的微小牛蜱Bm86基因,为获得基因工程疫苗的候选抗原及中国抗微小牛蜱疫苗制备奠定了基础。

微小牛蜱P0基因原核表达及表达产物的免疫原性分析

为了研究微小牛蜱P0蛋白的免疫原性,试验采用RT-PCR技术从微小牛蜱中扩增P0基因,将PCR产物克隆连入PET28a(+)载体构建重组表达载体PET28a-P0,再将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以IPTG诱导表达。结果表明:P0基因获得表达,表达的重组蛋白分子质量为35 ku,表达产物能被微小牛蜱阳性血清所识别。说明P0蛋白具有良好的免疫原性。

不同饱血状态微小牛蜱中肠和唾液菌群结构的分析

旨在探明微小牛蜱随吸血时间的延长,中肠和唾液微生物菌群结构的差异,以及优势菌属在中肠和唾液中增殖和迁移的特点。在无菌条件下采集半饱血、饱血微小牛蜱唾液和中肠内容物;提取细菌总DNA,PCR扩增其16SrDNA V3-V4区,Illumina MiSeq双端测序;对序列进行拼接和过滤、OTUs聚类、物种注释及多样性分析。结果显示,共得到134 317条序列,聚类后获得1 304个OTUs,半饱血雌成蜱唾液(SP)、饱血雌成蜱唾液(SF)、半饱血雌成蜱中肠内容物(MP)、饱血雌成蜱中肠内容物(MF)分别获得336、332、269、289个OTUs,其中152个OTUs为4个样本共有;4个样品在门水平上,以变形菌门和厚壁菌门为优势菌门,变形菌门在中肠中的含量大于唾液,而厚壁菌门反之;在属水平上,4个样本以柯克斯体属、不动杆菌属、甲基杆菌属、短波单胞菌属、立克次体属、埃希菌属为优势菌属,其中柯克斯体属、不动杆菌属在4个样本中含量均较大,柯克斯体属在半饱血状态下,含量高于饱血状态;不动杆菌属在唾液中的含量高于中肠。结果表明,微小牛蜱中肠和唾液中有复杂的微生物菌群结构;细菌在不同组织中的分布不同,其含量随吸血时间的延长而发生变化。

微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。

微小牛蜱Enolase基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为对微小牛蜱烯醇酶(Enolase)基因进行真核表达及免疫反应原性分析,本研究采用RT-PCR方法扩增微小牛蜱Enolase基因的开放阅读框(ORF)序列,将其克隆至pFastBac1载体中构建重组质粒pFastBac1-Enolase,随后转化至大肠杆菌DH10Bac细胞中制备了重组杆粒Bacmid-Enolase,转染至SF9细胞以获得重组Enolase蛋白。通过双酶切、PCR及测序鉴定显示Enolase基因正确插入。利用SDS-PAGE分析表达产物,结果显示目的蛋白大小约为48 ku。利用western blot对重组蛋白进行分析,结果表明目的蛋白能被微小牛蜱抗原免疫兔阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。凝血酶时间(TT)的测定结果显示,Enolase重组蛋白能显著延长TT,具有抗凝血活性。本研究首次采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对微小牛蜱Enolase基因进行真核表达,并鉴定了重组蛋白的免疫反应原性,为开展Enolase免疫原性分析及功能研究奠定了基础。

新疆南疆微小牛蜱Bm86/Bm91双基因原核表达载体的构建

为构建微小牛蜱Bm86和Bm91双基因原核表达载体,以新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室获得的Bm86和Bm91克隆基因阳性菌或质粒DNA为模板,参照GenBank登录的微小牛蜱Bm86和Bm91基因序列和所用载体序列,设计可以扩增Bm86和Bm91基因完整阅读框架的引物,然后对新疆南疆微小牛蜱Bm86和Bm91基因进行PCR扩增、纯化、酶切后连接,构建双基因重组质粒pET-32a-Bm并鉴定。结果显示,成功构建Bm86和Bm91双基因重组质粒pET-32a-Bm,经测序鉴定和初始获得的Bm86和Bm91基因序列一致,未发生变异。

微小牛蜱Bm86基因的克隆及真核表达载体的构建

为了克隆微小牛蜱Bm86 基因及构建该基因的表达载体,以微小牛蜱饥饿幼蜱的破解物提取的总RNA为模板,参照已发表的微小牛蜱Bm86基因的核苷酸序列,设计了1对引物,采用RT-PCR技术获得微小牛蜱Bm86基因;将Bm86基因克隆入载体,并进行序列分析,结果证明,克隆的Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因序列的同源性达97.4%,而且该序列包含完整的开放阅读框。将该基因克隆入真核表达载体 pPIC9K,构建并获得了重组真核表达载体pPIC9K-Bm86。

新疆南疆微小牛蜱Bm86基因及其编码蛋白剖析

为了能高效表达理想的微小牛蜱抗原,本研究对新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室已获得的Bm86基因（Bm86Tarim）进行遗传进化分析,并对其编码蛋白进行生物学信息分析。结果显示本研究获得的新疆南疆微小牛蜱Bm86Tarim序列与已登录的所有国外Bm86基因完整阅读框序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.9%-98.6%和93.8%-97.8%,差异极小;遗传进化树分析结果显示本研究毒株与已登录多数毒株在同一分支内;生物学信息预测结果显示该蛋白不稳定,不溶性的概率为93.26%,有4个潜在糖基化位点。本试验结果为后续Bm86基因表达、免疫抗原制备和抗微小牛蜱疫苗的研制奠定基础。

微小牛蜱染色体的多倍体和C带分析

本文首次报告了微小牛蟀染色体的C带，全部为端着丝粒，其中一对呈现双着丝粒。发现该蜱的4倍体：4n=44，并讨论了产生的机制。

福建省微小牛蜱的生物学特性

福州地区的微小牛蜱Boophilus microplus在牛体表终年均有寄生,以7、8、9、3个月为寄生高峰期。经人工饲养观察,每年发生4代。第一代需要63—88天,第二代42—56天,第三代44—62天,第四代90—152天。以第四代未吸血幼蜱或第三代未吸血幼蜱越冬。未吸血幼蜱最长能存活227天。雌蜱一生共产卵1589～4138粒(平均2986.3粒),产完卵后约0～14天死亡。饱血雄蜱一般存活不超过1个月。饱血雌蜱的体重与产卵量和产卵期呈相关[Y(产卵量)=00.945,P<0.01;r(产卵期)=0.490,p<0.05]。