Circ_0072088靶向miR⁃377促进肝癌细胞进展的机制研究

目的研究环状RNA 0072088(circ_0072088)在肝癌细胞及异种移植瘤模型中的生物学功能,并探讨其参与调控肝细胞癌(HCC)发生进展的关键机制。方法培养人正常肝细胞(THLE⁃2)和HCC细胞系(Huh⁃7、Hep G2、Hep 3B),采用RT⁃qPCR方法检测circ_0072088、miR⁃377和含三方基序23基因(TRIM23)mRNA表达水平;Western blot检测TRIM23蛋白表达水平。取Hep G2细胞分为sh⁃NC组、sh⁃circ_0072088组、mimic NC组、miR⁃377 mimic组,Huh⁃7细胞分为mimic NC组、miR⁃377 mimic组和circ_0072088+miR⁃377 mimic组。分别采用CCK8法、克隆形成试验测定各组细胞的增殖能力变化情况;Transwell实验检测迁移能力变化情况;根据circ_0072088与miR⁃377的结合位点设计并合成了circ_0072088⁃WT和circ_0072088⁃MT双荧光素酶报告质粒,并分别与miR⁃377 mimic或mimic NC共转染Hep G2细胞后使用双荧光素酶报告试剂盒测量荧光素酶活性;RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)测定Ago2或IgG RIP复合物中circ_0072088和miR⁃377的富集水平。在异种移植瘤裸鼠模型中探讨circ_0072088的体内功能。结果circ_0072088在HCC中较瘤旁组织表达上调。与THLE⁃2细胞比较,HCC细胞系(Huh⁃7、Hep G2、Hep 3B)circ_0072088的mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(t=13.77、30.11、33.27,P均<0.001)。与sh⁃NC组比较,Hep G2转染sh⁃circ_0072088后细胞中circ_0072088 mRNA表达降低,差异有统计学意义(t=23.31,P均<0.001),细胞增殖活力(48、72 h)、克隆形成能力和迁移能力降低,差异均有统计学意义(t=11.78、8.42、12.64,P均<0.01),TRIM23蛋白表达水平明显降低。RIP检测结果显示,相对于lgG,circ_0072088(t=60.59)和miR⁃377(t=35.68)在Ago2免疫沉淀中富集,差异均有统计学意义(P均<0.001)。双荧光素酶检测结果显示,与转染mimic⁃NC组比较,转染miR⁃377 mimic组含有circ_0072088⁃WT质粒细胞的荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(t=21.88,P<0.001)。RT⁃qPCR及Western blot结果显示,与mimic NC组相比,miR⁃377 mimic组中TRIM23 mRNA(t=8.45,P<0.001)和蛋白表达水平明显降低。在异种移植瘤裸鼠模型中,与sh⁃NC组相比,sh⁃circ_0072088组移植的肿瘤体积减小,肿瘤组织中circ_0072088和TRIM23 mRNA表达降低,而miR⁃377 mRNA表达升高,差异有统计学意义(t=8.63、5.56、5.52、11.97,P均<0.001),TRIM23的蛋白水平下降。结论circ_0072088通过结合miR⁃377,间接上调TRIM23的表达,从而促进HCC细胞的增殖和迁移。