血清微小RNA(miR-129-3p、miR-767-3p和miR-877*)在结直肠癌诊断中的价值

目的:探讨血清微小RNA(microRNA,miRNA)在结直肠癌诊断中的价值。方法:通过miRNA表达谱芯片检测7例结直肠癌患者血清和10例健康志愿者血清中差异表达的miRNA。应用实时荧光定量PCR法在40例结直肠癌患者血清和18例健康志愿者血清中验证芯片结果,并分析血清特异性miRNA在结直肠癌诊断中的价值。结果:筛选获得10个在结直肠癌中特异性表达的血清miRNA,实时荧光定量PCR验证后获得一组结直肠癌特异性血清miRNA(miR-129-3p、miR-767-3p及miR-877*)生物标志物,这组生物标志物组合检测结直肠癌的灵敏度为77.78%、特异度为100%,并可产生最大受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC)的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.914。结论:miR-129-3p、miR-767-3p和miR-877*生物标志物组合有望成为结直肠癌筛查和早期诊断的指标。

微小RNA-181a在人食管癌EC9706细胞中对靶基因PRDM1调控作用的研究

目的:构建微小RNA(microRNA,miR)-181a的真核表达载体和靶基因PRDM1(encoding PR domain containing1,with ZNF domain)的3'非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)荧光素酶报告载体,在人食管癌EC9706细胞中验证miR-181a对靶基因PRDM1的调控作用。方法:根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游200个碱基序列,以人食管癌KYSE150细胞基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增包含miR-181a前体的序列,克隆到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后亚克隆到质粒pCDNA3.1(+)上,对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。通过实时定量PCR法检测人食管癌EC9706细胞转染重组表达载体pCDNA3.1-miR-181a后成熟miR-181a的表达水平。应用生物信息学预测软件对miR-181a的靶基因进行预测,将候选靶基因PRDM1的3'UTR融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基因检测miR-181a对靶基因PRDM13'UTR的调控作用。将pCDNA3.1-miR-181a表达质粒转染到人食管癌EC9706细胞中,蛋白质印迹法检测其对PRDM1蛋白表达的影响。结果:成功构建miR-181a真核表达载体,实时定量PCR验证表明pCDNA3.1-miR-181a在EC9706细胞中能够过表达成熟miR-181a。生物信息学预测PRDM1可能是miR-181a的靶基因之一,于是构建了PRDM1的3'UTR荧光素酶报告载体pMIR-PRDM1,在此基础上对PRDM1的3'UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明,miR-181a能够作用于PRDM1基因的3'UTR。蛋白质印迹法进一步证实,miR-181a能够抑制性调控内源性PRDM1蛋白的表达。结论:MiR-181a作用于PRDM1基因的3'UTR,在转录后水平上调PRDM1蛋白的表达,提示PRDM1是miR-181a直接调控的靶基因。

miR-203对人食管癌细胞生物学行为的影响

目的研究miR-203的真核表达载体对人食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法扩增得到miR-203前体序列,插入表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR克隆得到pcDNA6.2-miR203。将真核表达载体pcDNA6.2-miR203转染至人食管鳞癌细胞系(EC-109)中,并采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)对其表达情况进行验证。进而分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、细胞划痕法和Boyden小室法检测转染重组质粒对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果成功构建真核表达载体pcDNA6.2-miR203;RT-PCR检测结果表明,过表达miR203的EC-109细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显减弱。结论 miR203有可能作为食管癌的候选肿瘤抑制物。

靶向PRMT2基因的micro RNA对雌激素介导的乳腺癌MCF7细胞增殖的影响

目的:构建靶向人蛋白质精氨酸甲基转移酶 2 (protein arginine methyltransferase2,PRMT2)基因的microRNA真核表达载体,鉴定其稳定转染乳腺癌细胞株MCF7后对细胞增殖的影响。方法:根据PRMT2mRNA序列设计合成pre-microRNA片段,定向克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体,并稳定转染入MCF7细胞。采用间接免疫荧光法和蛋白质印迹法检测重组体对PRMT2表达的干扰效果以确定其生物活性。采用结晶紫实验和平板克隆形成实验检测重组体转染对MCF7细胞体外增殖和细胞克隆形成能力的影响。FCM法检测重组体转染对MCF7细胞周期的影响。结果:构建的重组体插入片段的碱基序列完全正确,并且重组体稳定转染MCF7细胞后可成功干扰PRMT2基因的表达。在无处理因子的情况下,重组体转染对细胞的生长速度无明显影响;与转染空载体的MCF7细胞相比,稳定转染重组体的MCF7细胞对雌激素的敏感性增强,但其对雌激素拮抗剂4-OHT处理的敏感性无明显差异。平板克隆形成实验表明,重组体能够增强雌激素介导的MCF7细胞的克隆形成能力。FCM法检测表明,转染重组体的MCF7细胞中G2期细胞比例明显升高(P<0.05)。结论:成功构建靶向PRMT2基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体,且在稳定转染MCF7细胞后具有生物学活性。抑制内源性PRMT2基因的表达能够提高雌激素介导的MCF7细胞的增殖和克隆形成能力,上调雌激素受体α目标基因cyclinD1和c-myc的表达,促进细胞周期进程。

MicroRNA与DNA甲基化相互调节机制在肝细胞癌中的研究进展

肝细胞癌是原发性肝癌的主要类型,也是人类恶性程度较高的肿瘤之一,其发病机制至今尚未完全阐明。表观遗传学机制在肿瘤的发生、发展中起重要作用,DNA甲基化和微小RNA(microRNA,miRNA)的调控机制属于表观遗传学的研究范畴。研究表明,DNA甲基化及miRNA在肝细胞癌的形成中分别或协同发挥着重要作用,miRNA是一类在转录后水平调节基因表达的非编码短链RNA。研究表明,DNA甲基化和组蛋白修饰不仅可以调节蛋白编码基因的表达,而且可以调节miRNA的表达。在肝细胞癌中,一些异常表达的miRNAs(如miR-125b、miR-1-1、miR-124、miR-203和miR-191)是通过表观遗传学机制调控的。另外,在肝细胞癌中还发现了一类miRNAs通过调控表观遗传学通路中关键分子来改变整个基因组的表观遗传学状态。本文就DNA甲基化和miRNA之间复杂的相互调节机制在肝细胞癌发生和发展中的研究进展进行综述。

沉默microRNA-20a对乳腺癌MCF7细胞表达NK细胞活化性受体配体MICA的研究

目的:探讨沉默microRNA-20a对上调乳腺癌MCF7细胞膜表面MHCⅠ类链相关分子A(MHC classⅠchain-related molecules A,MICA)表达量的影响及其促进自然杀伤细胞(NK细胞)对MCF7细胞杀伤的作用。方法:在脂质体介导下用microRNA-20a抑制剂瞬时转染MCF7细胞,采用RT-PCR检测microRNA-20a的表达量以明确抑制效果;采用免疫印迹法检测转染后MCF7细胞表达MICA分子的变化以及采用结晶紫实验检测MCF7细胞经过转染后以及在加入MICA封闭抗体前后对NK细胞介导的杀伤活性的变化。结果:与转染无关序列组等比较,经过microRNA-20a抑制剂转染后MCF7细胞表达microRNA-20a下调,同时表达MICA蛋白分子上调;结晶紫法检测NK细胞对MCF7的杀伤活性,结果显示,经过microRNA-20a抑制剂转染后MCF7细胞的死亡率显著增加(P<0.01),同时MICA分子的封闭性抗体能够逆转MCF7细胞升高的死亡率。结论:沉默microRNA-20a能上调MCF7细胞表达NK细胞活化性杀伤受体的配体MICA分子,并导致MCF7细胞在NK细胞介导的杀伤实验中死亡率显著上升。以microRNA-20a为靶点的RNA干扰有望为增强肿瘤细胞的免疫原性从而上调NK细胞对其发挥杀伤作用提供新的靶点。

miR-181a对人食管癌TE11细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:通过构建miR-181a的真核表达载体,研究其对人食管癌TE11细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:以95C细胞基因组DNA为模板,扩增得到miR-181a前体序列,插入表达载体pcDNA3.1(+)克隆获得pcDNA3.1(+)-miR-181a。将真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-181a转染到TE11细胞中,并采用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogentic quantitative-PCR,RFQ-PCR)对其表达情况进行验证。分别采用MTT法、细胞划痕法和Boyden小室法检测转染重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-181a对TE11细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响。结果:成功构建了插入miR-181a基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-181a;RFQ-PCR检测结果表明,转染pcDNA3.1(+)-miR-181a的TE11细胞能够过表达成熟的miR-181a(P<0.05)。过表达miR-181a的TE11细胞增殖能力、迁移能力和细胞侵袭能力均明显增强。结论:miR-181a在TE11细胞中过表达能够增加细胞的增殖、迁移和侵袭能力,为进一步深入研究miR-181a在肿瘤中的作用机制提供了实验依据。

低氧对人肝癌HepG2细胞中HIF-1α及miR-210表达的影响

目的:研究低氧对人肝癌细胞株HepG2细胞表达缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF-1α)及缺氧特异性微小RNA-210(microRNA-210,miR-210)的影响,探讨肿瘤细胞在低氧环境下miR-210表达的变化情况。方法:HepG2细胞经体外常规培养后,用体积分数为1%的氧气分别培养HepG2细胞6、12、18和24h。应用实时荧光定量RT-PCR(real-time quantitative reverse transcriptionPCR,qRT-PCR)和蛋白质印迹法分别检测细胞中HIF-1αmRNA和蛋白的表达变化,同时用茎环RT-PCR检测miR-210的表达变化,分析HIF-1α与miR-210的表达关系。染色质免疫共沉淀PCR(chromatin immunoprecitation PCR,ChIP-PCR)分析HIF-1α与miR-210启动子结合的可能性。结果:低氧培养6～12h,HIF-1αmRNA的表达量存在明显改变(P<0.05),而其蛋白的表达量从低氧培养开始直至24h均有明显变化(P<0.005);与此同时,miR-210的表达量在低氧培养6～18h时出现明显改变(P<0.01),且与HIF-1α蛋白表达存在明显的线性相关(R=0.795,P=0.037)。进一步的ChIP-PCR实验表明,HIF-1α在HepG2细胞内可与miR-210启动子区近转录区的低氧反应元件(hypoxia response element,HRE)结合,从而发挥转录调控作用。结论:适度的低氧环境可能影响miR-210表达,其机制可能是通过HIF-1α结合其启动子来调节实现的。