转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的变化及其机制

目的观察转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性变化,并探讨其机制。方法培养卵巢癌SKOV3细胞,将SKOV3细胞分为观察组、对照组、单药组,三组均经0、6.25、25、100、400、1 600 ng/m L紫杉醇处理,观察组转染miR-101类似物,对照组转染无关序列,单药组不转染任何序列,MTT法观察各组细胞增殖能力,Annexin V-FITC/PI法测算各组细胞凋亡率。采用Western blotting法检测25 ng/m L紫杉醇注射液作用的观察组、对照组、单药组细胞DNMT3A蛋白。结果 0、6.25、25、100、400、1 600 ng/m L紫杉醇注射液作用的观察组细胞OD值分别为0.632±0.014、0.554±0.012、0.503±0.015、0.428±0.011、0.346±0.006、0.301±0.007,单药组分别为0.718±0.013、0.687±0.015、0.619±0.011、0.554±0.009、0.473±0.008、0.420±0.011,对照组分别为0.713±0.016、0.671±0.011、0.626±0.010、0.549±0.008、0.467±0.010、0.412±0.008,观察组与对照组相比,P均<0.05。0、6.25、25、100、400、1 600 ng/m L紫杉醇注射液作用的观察组细胞凋亡率分别为9.63%±0.38%、14.71%±0.64%、21.27%±0.79%、27.05%±0.92%、31.82%±1.07%、35.51%±1.63%,单药组分别为3.61%±0.24%、6.18%±0.48%、9.57%±0.42%、15.64%±0.75%、18.79%±1.12%、22.05%±1.34%,对照组分别为3.74%±0.29%、6.02%±0.35%、10.63%±0.58%、15.21%±0.84%、19.37%±1.26%、23.30%±1.18%,观察组与对照组相比,P均<0.05。观察组、对照组、单药组细胞中DNMT3A蛋白相对表达量分别为0.427±0.068、0.961±0.107,0.947±0.113,三组比较,P<0.05。结论转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性增强,miR-101可能通过靶向调控DNMT3A诱导卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。

转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力及M2型丙酮酸激酶表达变化

目的观察转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力及M2型丙酮酸激酶(PKM2)表达变化。方法培养人胃腺癌MGC-803细胞,将其分为观察组1、对照组1、观察组2、对照组2,观察组1转染miR-185类似物,对照组1转染无关序列,观察组2转染PKM2小RNA干扰,对照组2转染RNA干扰无关序列,48 h后收集观察组1和对照组1细胞,用Western blotting法检测PKM2蛋白,用实时荧光定量PCR法检测PKM2 mRNA;将四组细胞继续培养24、48、72、96 h,采用MTT法测量各组在570 nm波长处的OD值。结果细胞培养48、72、96h时,OD值观察组1较对照组1低(P均<0.05),观察组2较对照组2低(P均<0.05)。观察组1、对照组1人胃腺癌MGC-803细胞PKM2蛋白相对表达量分别为0.522±0.065、0.937±0.111,PKM2 mRNA相对表达量分别为0.584±0.037、1.046±0.058,两组比较,P<0.05或<0.01。结论转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力下降、PKM2表达降低,miR-185的这一作用是通过下调PKM2实现的。

致癌性微小RNA-106a对正常胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞生长的影响

目的:探讨微小RNA-106a(miR-106a)是否具有致癌特性。方法:用脂质体把miR-106a类似物转染到正常胃黏膜上皮细胞GES-1中,然后用MTT方法检测该细胞的增殖情况。用脂质体把miR-106a抑制剂转染到胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中,然后分别用流式细胞术和Western印迹方法检测细胞周期分布和细胞周期相关蛋白表达的变化;最后观察裸鼠胃癌移植瘤的生长情况。结果:miR-106a类似物以剂量依赖方式促进正常胃黏膜上皮细胞的增殖。miR-106a抑制剂通过抑制细胞周期素依赖的蛋白激酶(CDK)1和CDK2的表达阻滞MGC-803细胞于G0/G1期和G2/M期,而通过抑制CDK1的表达阻滞SGC-7901于G2/M期。动物实验结果显示,miR-106a抑制剂以剂量依赖方式抑制肿瘤的生长。结论:miR-106a可能参与了胃癌的发生过程。

Rhopaladins类似物对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的观察Rhopaladins类似物(RPDPB)对宫颈Hela细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法取对数生长期Hela细胞,将细胞分为实验组、对照组、空白组,实验组又分为不同剂量组,不同剂量组分别以3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/L RPDPB干预,对照组只加DMSO培养液,空白组加入不含细胞的MEM培养液,分别于24、48、72 h采用CCK-8法检测OD值,计算细胞增殖抑制率。取对数生长期Hela细胞,将细胞分为实验组、对照组,实验组又分为不同剂量组,不同剂量组分别以12.5、25、50μmol/L RPDPB干预,对照组只加DMSO不加药,48 h后采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测Annexin V-FITC和PI,计算细胞凋亡率。取对数生长期Hela细胞,将细胞分为实验组、对照组,实验组又分为不同剂量组,不同剂量组分别以12.5、25、50μmol/L RPDPB干预,对照组只加DMSO不加药,48 h后采用RT-PCR法检测细胞人乳头瘤病毒18 E6(HPV18 E6)、人乳头瘤病毒18 E7(HPV18 E7)、WNT2B、β-catenin mRNA和miR-145 RNA。取对数生长期Hela细胞,将细胞分为实验组、对照组,实验组又分为不同剂量组,不同剂量组分别以12.5、25、50μmol/L RPDPB干预,对照组只加DMSO不加药,48 h后采用Western blot法检测细胞WNT2B、β-catenin蛋白。结果与对照组比较,实验组细胞增殖抑制率增加,且呈时间和剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率增加,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA相对表达量降低,miR-145 RNA相对表达量升高,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组WNT2B、β-catenin蛋白相对表达量降低,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。结论RPDPB可抑制宫颈癌Hela细胞增殖,并诱导细胞凋亡,呈时间和剂量依懒性,作用机制可能是其通过下调HPVE6/E7 mRNA表达,导致miR-145 RNA表达上调,进而抑制下游WNT2B/β-catenin通路中WNT2B、β-catenin mRNA和蛋白表达。

微小RNA-101靶向果蝇zeste基因增强子同源物2基因对人前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响

目的 观察微小RNA-101（miR-101）通过靶向抑制果蝇zeste基因增强子同源物2（EZH2）基因对人前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响.方法 应用miR-101模拟物转染PC-3细胞;实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）和Western blot法检测转染后miR-101和EZH2的表达;噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期;膜联蛋白V（Annexin V）/碘化丙锭（PI）双染色法测量细胞凋亡率;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力.结果 miR-101在PC-3细胞中的表达明显低于RWPE-1细胞,EZH2 mRNA和蛋白在PC-3细胞中的表达显著高于RWPE-1细胞,miR-101的表达量与EZH2表达量呈负相关（P＜0.05）.miR-101模拟物转染PC-3细胞后,细胞中的miR-101表达上调（P＜0.05）,而EZH2 mRNA和蛋白表达水平也明显降低（P＜0.05）.MTT法显示：转染后48、72、96 h miR-101模拟物转染组细胞增殖明显低于两个对照组（P＜0.05）;流式细胞仪测定结果显示：转染后48 h,miR-101组发生了G0/G1期阻滞（P＜0.05）;细胞凋亡率检测结果显示：空白对照组、阴性对照组及miR-101模拟物转染组PC-3细胞凋亡率分别为（2.53±0.36）％、（2.71±0.42）％、（9.84±0.83）％,转染组凋亡率明显高于两个对照组（P＜0.01）.划痕实验显示：miR-101模拟物转染组细胞迁移能力明显低于两个对照组（P＜0.01）.Transwell侵袭实验结果显示：miR-101组穿过Matrigel凝胶的细胞数显著少于两个对照组（P＜0.01）.结论 miR-101负向调控EZH2基因,上调miR-101可抑制PC-3细胞中EZH2的表达,具有显著的肿瘤抑制效应.

微小RNA-101-3p对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响

目的探讨微小RNA-101-3p(miR-101-3p)调控Notch同源物1(Notch1)对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响。方法将A2780/Taxol细胞分为紫杉醇组(用1.8μmol·L^(-1)紫杉醇处理),第1转染组(转染miR-101-3p mimics,用1.8μmol·L^(-1)紫杉醇处理),第2转染组(转染pcDNA3.1-Notch1,用1.8μmol·L^(-1)紫杉醇处理),第3转染组(同时转染pcDNA3.1-Notch1和miR-101-3p mimics,用1.8μmol·L^(-1)紫杉醇处理)。用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-101-3p在A2780和A2780/Taxol细胞中的表达水平。48 h后,用CCK-8检测细胞增殖活性。用流式细胞术检测细胞周期,用蛋白质印迹(Western blot)法检测Notch1的表达水平。结果miR-101-3p在A2780和A2780/Taxol细胞中的表达水平分别为1.00±0.04,0.35±0.05,差异有统计学意义(P<0.05)。紫杉醇组、第1转染组、第2转染组、第3转染组的细胞48 h增殖率分别为(141.82±5.45)%,(106.06±7.35)%,(184.24±8.20)%,(146.06±7.57)%;G0/G1期细胞百分比分别为(40.17±2.93)%,(53.38±2.56)%,(19.97±3.22)%,(35.49±4.51)%;S期细胞百分比分别为(36.74±4.07)%,(33.05±3.13)%,(40.12±3.29)%,(37.05±2.39)%;G2/M期细胞百分比分别为(23.09±1.42)%,(13.57±0.58)%,(39.92±2.68)%,(27.46±4.59)%;Notch1的相对表达水平分别为1.03±0.09,0.53±0.04,1.89±0.21,1.26±0.11。第1转染组、第2转染组分别与紫杉醇组比较,第3转染组与第2转染组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论miR-101-3p在紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol中低表达,过表达miR-101-3p可通过靶向下调Notch1的表达增强A2780/Taxol细胞紫杉醇敏感性。

微小RNA-101在结肠癌组织的表达及其与患者预后的关系

目的 探讨微小RNA（miRNA,miR）-101在结肠癌组织中表达及与患者预后的关系.方法 选取择期行根治性手术治疗的结肠癌患者137例,利用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测结肠癌及癌旁组织中miR-101和Zeste基因增强子人类同源物-2（EZH-2）基因表达,根据结肠癌组织中miR-101表达量的四分位数间距,将患者分为高表达组[表达量≥上四分位数（P25）]和低表达祖（表达量＜ P25）,所有患者随访至2015年7月31日,利用Kaplan-Meier法分析患者术后总体生存时间,利用Cox比例风险模型分析影响患者术后总体生存时间的相关因素.结果 结肠癌组织中miR-101表达量显著低于癌旁组织,而EZH-2 mRNA表达量则高于癌旁组织,差异均有统计学意义（P＜0.05）;结肠癌组织中miR-101和EZH-2 mRNA表达量均与分化程度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关（P＜0.05）;Pearson相关分析显示,结肠癌组织中miR-101表达量与EZH-2 mRNA表达量呈负相关（r=-0.348,P＜0.05）;生存分析显示,高表达组患者术后总体生存时间为51.5个月,显著高于低表达组的30.9个月,差异有统计学意义（x2=10.903,P＜0.01）;Cox比例风险模型分析显示,miR-101[风险比（HR）=0.492,95％可信区间（CI）：0.334 ～0.795,P＜0.05]和TNM分期（HR=2.576,95％CI：1.572～3.874,P＜0.05）是影响结肠癌患者术后总体生存时间的独立风险因素.结论 结肠癌组织中miR-101呈低表达,可能与结肠癌发生及转移过程有关,可作为患者术后生存时间的预测指标,其机制可能与上调EZH2表达有关.

miR-543靶向TCF7L2调控BMSCs成脂分化的实验研究

目的探讨微小RNA-543(miR-543)靶向调控转录因子7类似物2(TCF7L2)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成脂分化的影响。方法分离并鉴定大鼠BMSCs,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测BMSCs成脂分化诱导过程中miR-543的表达变化;体外培养BMSCs细胞,对BMSCs细胞进行干预,过表达miR-543、抑制TCF7L2表达或同时过表达miR-543与TCF7L2,使用成脂分化诱导培养基培养,油红O染色检测BMSCs成脂分化;免疫印迹法检测BMSCs细胞TCF7L2、脂肪细胞蛋白2(aP2)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-543与TCF7L2的靶向关系。结果成功分离大鼠BMSCs;BMSCs成脂分化诱导处理1、2、3、4、5 d后miR-543表达水平降低;双荧光素酶报告基因实验证实miR-543与TCF7L2存在靶向关系;过表达miR-543或抑制TCF7L2表达,BMSCs油红O染色后OD值、aP2、PPAR-γ、C/EBPα蛋白表达水平显著降低(P<0.05);过表达TCF7L2可部分逆转过表达miR-543对BMSCs细胞成脂分化的抑制作用(P<0.05)。结论miR-543在大鼠BMSCs细胞成脂分化过程中下调表达,过表达miR-543可通过靶向抑制TCF7L2表达而抑制BMSCs细胞成脂分化。

miR-6883-3p靶向CHD1L抑制肝癌细胞的恶性表型

目的:寻找可靶向调控恶性肿瘤相关染色质解旋因子CHD1L的miRNAs分子,确证该调控模式对肝癌细胞恶性表型的影响。方法:通过生物信息学分析预测并筛选可靶向结合CHD1L的miRNAs,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹分析(Western Blot)方法验证所筛选的miRNAs对肝癌细胞CHD1L表达的影响,明确可转录后调控CHD1L表达的关键miRNA分子;qRT-PCR检测肝癌组织中miRNAs和CHD1L的表达,并对其表达进行相关性分析;MTS、细胞划痕、Transwell迁移实验验证目标miRNA分子对肝癌细胞恶性表型的影响。结果:生物信息学分析结果显示miR-6883-3p可显著下调肝癌细胞CHD1L表达。双荧光素酶报告实验检测结果证明miR-6883-3p可直接靶向结合CHD1L 3'UTR端。临床肝癌组织样本qRT-PCR检测及统计学分析结果显示CHD1L高表达于肝癌组织,而miR-6883-3p则高表达于癌旁组织,二者表达呈负相关。miR-6883-3p模拟物(mimic)可明显抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移;而miR-6883-3p抑制剂(inhibitor)可显著促进肝癌细胞增殖、促进细胞迁移。与对照组(Mock)相比,miR-6883-3p mimic组肝癌细胞内ALB表达则随着CHD1L表达的下调而增加,HNF-4α及AFP随着CHD1L表达的下调而减少,反之亦然。结论:miR-6883-3p通过靶向调控CHD1L表达,抑制肝癌细胞的恶性表型。