冬凌草乙素联合放疗对肺癌A549细胞凋亡的协同作用及miR-16-5p/WEE1信号轴的影响

目的:探讨冬凌草乙素联合放疗对肺癌A549细胞凋亡的协同作用及微小RNA-16-5p(miR-16-5p)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(WEE1)信号轴的影响。方法:设A549细胞组、放疗组(6 Gy·min^(-1)的固定剂量率发射,照射孵育24 h)、冬凌草乙素组(20 mg·L^(-1))、放疗+冬凌草乙素组(冬凌草乙素浓度为20 mg·L^(-1),并以6 Gy·min^(-1)的固定剂量率发射,照射孵育24 h);培养结束后,CCK-8法测定细胞增殖水平,Transwell腔室系统测定细胞侵袭水平,流式细胞仪测定细胞凋亡水平,实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹法测定细胞miR-16-5p、WEE1 mRNA和蛋白水平。结果:与A549细胞组比较,放疗组、冬凌草乙素组、放疗+冬凌草乙素组光密度(OD)值、存活率、穿膜数、WEE1 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-16-5p表达显著升高(P<0.05);与放疗组、冬凌草乙素组比较,放疗+冬凌草乙素组OD值、存活率、穿膜数、WEE1 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-16-5p表达显著升高(P<0.05)。结论:冬凌草乙素联合放疗对肺癌A549细胞凋亡具有协同作用,其机制可能与冬凌草乙素促进miR-16-5p的表达进而抑制WEE1表达有关。

长链非编码RNA LINC00662/微小RNA-16-5p/wee1信号通路对肝细胞癌细胞增殖及凋亡的作用研究

目的探讨长链非编码RNA linc00662(LncRNA linc00662)通过微小RNA-16-5p(miR-16-5p)[/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(wee1)]信号轴在肝细胞癌(HCC)细胞增殖及凋亡中的作用。方法该研究时间为2019年8月至2020年10月,体外培养正常肝细胞株LO2和肝癌细胞株SK-HEP-1、HepG2、Huh-7和Li-7。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中linc00662、miR-16-5p和wee1的表达。以HepG2细胞作为研究对象,设置shRNA阴性对照(sh-NC)组、linc00662-shRNA干扰(sh-linc00662)组、抑制剂阴性对照(inhibitor-NC)组、miR-16-5p抑制剂(miR-16-5p inhibitor)组、siRNA阴性对照(si-NC)组、wee1-siRNA干扰(siwee1)组、linc00662-shRNA干扰联合miR-16-5p抑制剂(sh-linc00662+miR-16-5p inhibitor)组和miR-16-5p抑制剂联合wee1-siRNA干扰(miR-16-5p inhibitor+si-wee1)组。CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)]表达。双萤光素酶报告基因实验检测linc00662、miR-16-5p和wee1之间的相关性。结果PCR结果显示相比较LO2细胞,linc00662在SK-HEP-1、HepG2、Huh-7和Li-7细胞中普遍高表达[0.95±0.14比2.12±0.17、3.86±0.15、2.31±0.14、1.82±0.18,P<0.001]。与sh-NC组相比,敲低linc00662能抑制肝癌细胞增殖(P<0.001)并诱导细胞凋亡(P<0.001)。双萤光素酶报告结果显示linc00662直接靶向结合miR-16-5p并负调控miR-16-5p的表达。同时,miR-16-5p直接靶向结合wee1并负调控wee1的表达。下调miR-16-5p表达可以减轻敲低linc00662对肝癌细胞生长的抑制作用。此外,linc00662可能通过miR-16-5p/wee1通路发挥促癌作用。结论Linc00662是一种在肝癌细胞中上调的LncRNA,可以通过miR-16-5p/wee1轴促进肝癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。

吡非尼酮通过miRNA-425-5p调控TGF-β/Smad通路对大鼠心肌纤维化的影响

目的探讨吡非尼酮通过调控miRNA-425-5p及转化生长因子(TGF)-β/Smad通路改善心肌梗死大鼠心肌纤维化程度的作用。方法将60只雄性SD大鼠分为3组:假手术组(不结扎冠状动脉)、模型组、吡非尼酮组(吡非尼酮0.3 g/kg灌胃)。造模4周后采用心脏多普勒超声评价各组大鼠心脏功能;酶联免疫吸附试验检测血浆中白细胞介素6(IL-6)、Ⅰ型胶原蛋白α2(COL1α2)、Ⅲ型胶原蛋白α1(COL3α1)的水平;采用Masson染色法评价大鼠心肌纤维化程度,使用Image-Pro Plus 6.0分析各组心肌胶原容积分数;Western blot检测心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达水平;实时荧光定量PCR(qPCR)检测心肌组织中TGF-β1和miRNA-425-5p表达水平。同时在体外分离、培养乳鼠心肌成纤维细胞,分为对照组(不加任何物质)、miRNA-425-5p mimic组(加入转染miRNA-425-5p mimic)、吡非尼酮组(加入1.5 g/L的吡非尼酮)。采用qPCR检测各组miRNA-425-5p和TGF-β1 mRNA表达水平。结果模型组大鼠与假手术组相比心脏左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室收缩末期内径(LVESd)增大,左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(FS)降低(P<0.05);Masson染色及定量分析结果显示心肌纤维化加重;炎性因子IL-6、COL3α1、COL1α2水平明显升高(P<0.05);心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达升高,miRNA-425-5p表达水平降低(均P<0.05)。吡非尼酮组与模型组相比,LVEDd、LVESd缩小,LVEF、FS升高(P<0.05),Masson染色及定量分析结果示心肌纤维化程度减轻,血浆炎性因子IL-6、COL3α1、COL1α2水平明显降低(P<0.05);心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达水平降低,miRNA-425-5p表达水平升高(均P<0.05)。体外细胞实验结果表明,miRNA-425-5p mimic组与对照组相比,miRNA-425-5p表达水平升高,TGF-β1 mRNA表达水平降低(P<0.05)。吡非尼酮组与对照组相比,miRNA-425-5p表达水平升高,TGF-β1 mRNA表达水平降低(P<0.05)。结论吡非尼酮可通过调节miRNA-425-5p表达水平调控TGF-β/Smad信号通路,减轻心肌纤维化,改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心脏功能。

血清miR-124-3p、miR-361-5p与晚期胃癌患者临床病理特征、化疗敏感性和PI3K/AKT/mTOR信号通路的关系

目的 分析血清微小RNA(miR)-124-3p、miR-361-5p与晚期胃癌患者临床病理特征、化疗敏感性和磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路的关系。方法 选取2020年3月—2022年2月云南省第三人民医院消化内科收治的晚期胃癌患者90例为研究组,另选取同期医院健康体检者45例为健康对照组。比较2组血清miR-124-3p、miR-361-5p表达水平,分析血清miR-124-3p、miR-361-5p与晚期胃癌患者临床病理特征及PI3K、AKT、mTOR mRNA水平的相关性。结果 研究组血清miR-124-3p、miR-361-5p相对表达量低于健康对照组(t/P=34.613/<0.001、31.233/<0.001)。低分化晚期胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p水平低于中分化和高分化患者(P<0.05),且中分化患者血清miR-124-3p水平低于高分化患者(P<0.05),而中分化与高分化患者血清miR-361-5p水平比较差异无统计学意义(P>0.05);TNM分期Ⅳ期血清miR-124-3p、miR-361-5p水平低于ⅢB期患者(t/P=17.314/<0.001、20.734/<0.001)。90例患者完成2个周期以上化疗,化疗敏感占37.78%(34/90),化疗抵抗占62.22%(56/90)。化疗敏感亚组血清miR-124-3p、miR-361-5p相对表达量高于化疗抵抗亚组(t/P=33.766/<0.001、32.659/<0.001),化疗敏感亚组PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量低于化疗抵抗亚组(t/P=14.134/<0.001、15.936/<0.001、7.104/<0.001)。Pearson相关性分析结果显示,晚期胃癌患者血清miR-124-3p、miR-361-5p与PI3K、AKT、mTOR相对表达量均呈负相关(miR-124-3p:r/P=-0.315/0.011、-0.402/0.002、-0.554/<0.001;miR-361-5p:r/P=-0.356/0.006、-0.427/<0.001、-0.510/<0.001)。结论 血清miR-124-3p、miR-361-5p与晚期胃癌分化程度、TNM分期及化疗敏感性有关,可能通过负调控PI3K/AKT/mTOR信号通路而与化疗抗性有关。

LINC00839调节miR-17-5p/WEE1轴对结直肠癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的探究长链非编码RNA LINC00839(LINC00839)调节微小RNA-17-5p(miR-17-5p)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(WEE1)轴对结直肠癌(CRC)细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法检测CRC细胞系中LINC00839、miR-17-5p、WEE1 mRNA表达水平,筛选最佳细胞系,将LS513细胞分为对照组(Control组)、LINC00839敲低阴性对照组(si-NC组)、LINC00839敲低组(si-LINC00839组)、LINC00839敲低+miR-17-5p抑制表达阴性对照组(si-LINC00839+NC inhibitor组)、LINC00839敲低+miR-17-5p抑制表达组(si-LINC00839+miR-17-5p inhibitor组)。qRT-PCR检测细胞中LINC00839、miR-17-5p和WEE1 mRNA表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证LINC00839、miR-17-5p和WEE1之间的靶向关系;MTT检测细胞活力;Edu检测细胞增殖;划痕实验检测细胞的迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测WEE1、PCNA、Bax、Bcl-2、caspase-3、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平。结果在CRC细胞系中LINC00839、WEE1 mRNA高表达,miR-17-5p低表达,选择LS513细胞进行实验。双荧光素酶报告基因实验证实miR-17-5p与LINC00839、WEE1存在靶向关系,LINC00839敲低可上调miR-17-5p表达,下调WEE1表达。敲低LINC00839能显著降低LS513细胞活力、Edu阳性率、划痕愈合率及PCNA、Bcl-2、N-cadherin和WEE1蛋白表达(P<0.05),显著增加Bax、caspase-3、E-cadherin蛋白表达(P<0.05)。抑制miR-17-5p的表达能逆转LINC00839敲低对LS513细胞恶性生物学行为的抑制作用(P<0.05)。结论LINC00839在CRC细胞中上调,敲低LINC00839可能通过调控miR-17-5p/WEE1轴抑制CRC细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡。

胎儿颈项透明层厚度检测联合母体血浆miR-22-3p、RIPK1浓度对胎儿先天性心脏病的诊断价值

目的 探究胎儿颈项透明层(nuchal translucency,NT)厚度联合母体血浆微小RNA-22-3p(micro RNA-22-3p,miR-22-3p)、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(receptor-interacting serine/threonine protein kinase 1,RIPK1)对胎儿先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)的诊断价值。方法 选择2018年3月至2020年10月在北部战区总医院产科确诊怀有CHD胎儿的孕妇57例为观察对象(CHD组),选择同期怀有健康胎儿的孕妇60名为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测孕妇血浆中miR-22-3p浓度,酶联免疫吸附法检测孕妇血浆中RIPK1浓度,超声检查胎儿NT厚度,Pearson法分析miR-22-3p、RIPK1的相关性,受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析胎儿NT厚度联合血浆miR-22-3p、RIPK1对胎儿CHD的预测价值。结果 两组孕妇年龄、孕周及胎儿性别之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组[(2.14±0.32)mm、(2.23±0.54)ng/mL、1.05±0.14]比较,CHD组胎儿NT厚度[(2.93±0.45)mm]增加,血浆RIPK1[(5.68±1.73)ng/mL]浓度显著升高,miR-22-3p(0.67±0.10)浓度显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);相关性分析显示,CHD组血浆RIPK1与miR-22-3p浓度呈负相关性(r=-0.448,P<0.05);NT厚度、血浆RIPK1、miR-22-3p联合预测胎儿CHD的敏感度为89.47%,特异度为85.00%,曲线下面积为0.933。结论 CHD胎儿NT厚度增加,母体血浆中miR-22-3p浓度降低,RIPK1浓度升高;胎儿NT厚度联合母体血浆miR-22-3p、RIPK1浓度检测对胎儿CHD具有一定诊断价值。

微小RNA-21-5p通过激活PI3K/Akt信号通路调控Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡减轻大鼠高氧性急性肺损伤

目的探讨微小RNA-21-5p(miR-21-5p)是否通过激活磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路调控Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)凋亡减轻高氧性急性肺损伤(HALI)。方法将72只雄性SD大鼠按随机数字表法分为常氧对照组、HALI组、PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002+HALI组(LY+HALI组)、miR-21-5p过表达+LY294002+HALI组(miR-21-5p+LY+HALI组)、miR-21-5p过表达+HALI组(miR-21-5p+HALI组)及二甲基亚砜(DMSO)+HALI组,每组12只。用95%氧气制备HALI动物模型;常氧对照组动物在常氧状态下正常饲养。制模前3周经气管导管滴入200μL滴度(1×10^(12) TU/mL)的miR-21-5p腺相关病毒载体AAV6-miR-21-5p转染肺组织;DMSO及LY294002均以0.3 mg/kg于制模前1 h经尾静脉给药。制模后48 h,取颈动脉血检测氧合指数(OI)及呼吸指数(RI),采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-21-5p表达;取肺组织,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子〔肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL-6、IL-1β)〕水平,测定肺湿/干质量(W/D)比值,苏木素-伊红(HE)染色后光镜下观察肺组织病理学改变并进行病理学评分。每组取6只大鼠提纯AECⅡ细胞,应用流式细胞仪检测凋亡率,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)和PI3K/Akt信号通路蛋白的表达水平。结果与常氧对照组比较,高氧暴露后可见肺泡间隔增厚,大量炎症细胞浸润,RI、炎症因子、肺W/D比值、病理学评分,以及AECⅡ细胞早期凋亡率、PTEN蛋白表达和Akt磷酸化水平均升高,而OI及miR-21-5p表达降低,说明模型制备成功。LY294002预处理后,可进一步加重HALI大鼠肺组织病理损伤,RI、炎症因子、肺W/D比值均较HALI组进一步升高,OI进一步降低,同时可促进AECⅡ细胞凋亡,进一步上调PTEN蛋白表达,并抑制Akt磷酸化;而miR-21-5p预处理可负向调控PTEN,激活PI3K/Akt信号通路,抑制AECⅡ细胞凋亡,减轻HALI,与LY+HALI组比较,炎症因子水平降低〔TNF-α(μg/L):100.33±3.48比116.55±2.53,IL-6(ng/L):141.06±3.70比161.31±3.59,IL-1β(μg/L):90.82±3.69比112.23±2.87,均P<0.05〕,RI、肺损伤病理学评分、肺W/D比值及AECⅡ细胞早期凋亡率明显降低〔RI:0.81±0.02比1.05±0.07,病理学评分(分):0.304±0.008比0.359±0.007,肺W/D比值:5.29±0.03比5.52±0.08,细胞凋亡率:(27.20±2.34)%比(34.17±1.49)%,均P<0.05〕,OI、miR-21-5p表达均明显升高〔OI(mmHg,1 mmHg≈0.133 kPa):266.71±2.75比230.12±4.04,miR-21-5p(2^(-ΔΔCt)):2.21±0.13比0.33±0.03,均P<0.05〕,且AECⅡ细胞PTEN蛋白表达显著降低(PTEN/GAPDH:0.50±0.06比0.93±0.06,P<0.05),Akt磷酸化明显增加〔磷酸化Akt(p-Akt)蛋白(p-Akt/GAPDH):0.86±0.05比0.56±0.06,P<0.05〕。结论miR-21-5p可能通过负向调控PTEN激活PI3K/Akt信号通路,从而抑制AECⅡ细胞凋亡,减轻HALI。