转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力及M2型丙酮酸激酶表达变化

目的观察转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力及M2型丙酮酸激酶(PKM2)表达变化。方法培养人胃腺癌MGC-803细胞,将其分为观察组1、对照组1、观察组2、对照组2,观察组1转染miR-185类似物,对照组1转染无关序列,观察组2转染PKM2小RNA干扰,对照组2转染RNA干扰无关序列,48 h后收集观察组1和对照组1细胞,用Western blotting法检测PKM2蛋白,用实时荧光定量PCR法检测PKM2 mRNA;将四组细胞继续培养24、48、72、96 h,采用MTT法测量各组在570 nm波长处的OD值。结果细胞培养48、72、96h时,OD值观察组1较对照组1低(P均<0.05),观察组2较对照组2低(P均<0.05)。观察组1、对照组1人胃腺癌MGC-803细胞PKM2蛋白相对表达量分别为0.522±0.065、0.937±0.111,PKM2 mRNA相对表达量分别为0.584±0.037、1.046±0.058,两组比较,P<0.05或<0.01。结论转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力下降、PKM2表达降低,miR-185的这一作用是通过下调PKM2实现的。

转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的变化及其机制

目的观察转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性变化,并探讨其机制。方法培养卵巢癌SKOV3细胞,将SKOV3细胞分为观察组、对照组、单药组,三组均经0、6.25、25、100、400、1 600 ng/m L紫杉醇处理,观察组转染miR-101类似物,对照组转染无关序列,单药组不转染任何序列,MTT法观察各组细胞增殖能力,Annexin V-FITC/PI法测算各组细胞凋亡率。采用Western blotting法检测25 ng/m L紫杉醇注射液作用的观察组、对照组、单药组细胞DNMT3A蛋白。结果 0、6.25、25、100、400、1 600 ng/m L紫杉醇注射液作用的观察组细胞OD值分别为0.632±0.014、0.554±0.012、0.503±0.015、0.428±0.011、0.346±0.006、0.301±0.007,单药组分别为0.718±0.013、0.687±0.015、0.619±0.011、0.554±0.009、0.473±0.008、0.420±0.011,对照组分别为0.713±0.016、0.671±0.011、0.626±0.010、0.549±0.008、0.467±0.010、0.412±0.008,观察组与对照组相比,P均<0.05。0、6.25、25、100、400、1 600 ng/m L紫杉醇注射液作用的观察组细胞凋亡率分别为9.63%±0.38%、14.71%±0.64%、21.27%±0.79%、27.05%±0.92%、31.82%±1.07%、35.51%±1.63%,单药组分别为3.61%±0.24%、6.18%±0.48%、9.57%±0.42%、15.64%±0.75%、18.79%±1.12%、22.05%±1.34%,对照组分别为3.74%±0.29%、6.02%±0.35%、10.63%±0.58%、15.21%±0.84%、19.37%±1.26%、23.30%±1.18%,观察组与对照组相比,P均<0.05。观察组、对照组、单药组细胞中DNMT3A蛋白相对表达量分别为0.427±0.068、0.961±0.107,0.947±0.113,三组比较,P<0.05。结论转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性增强,miR-101可能通过靶向调控DNMT3A诱导卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。

致癌性微小RNA-106a对正常胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞生长的影响

目的:探讨微小RNA-106a(miR-106a)是否具有致癌特性。方法:用脂质体把miR-106a类似物转染到正常胃黏膜上皮细胞GES-1中,然后用MTT方法检测该细胞的增殖情况。用脂质体把miR-106a抑制剂转染到胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中,然后分别用流式细胞术和Western印迹方法检测细胞周期分布和细胞周期相关蛋白表达的变化;最后观察裸鼠胃癌移植瘤的生长情况。结果:miR-106a类似物以剂量依赖方式促进正常胃黏膜上皮细胞的增殖。miR-106a抑制剂通过抑制细胞周期素依赖的蛋白激酶(CDK)1和CDK2的表达阻滞MGC-803细胞于G0/G1期和G2/M期,而通过抑制CDK1的表达阻滞SGC-7901于G2/M期。动物实验结果显示,miR-106a抑制剂以剂量依赖方式抑制肿瘤的生长。结论:miR-106a可能参与了胃癌的发生过程。

Rhopaladins类似物对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的观察Rhopaladins类似物(RPDPB)对宫颈Hela细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法取对数生长期Hela细胞,将细胞分为实验组、对照组、空白组,实验组又分为不同剂量组,不同剂量组分别以3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/L RPDPB干预,对照组只加DMSO培养液,空白组加入不含细胞的MEM培养液,分别于24、48、72 h采用CCK-8法检测OD值,计算细胞增殖抑制率。取对数生长期Hela细胞,将细胞分为实验组、对照组,实验组又分为不同剂量组,不同剂量组分别以12.5、25、50μmol/L RPDPB干预,对照组只加DMSO不加药,48 h后采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测Annexin V-FITC和PI,计算细胞凋亡率。取对数生长期Hela细胞,将细胞分为实验组、对照组,实验组又分为不同剂量组,不同剂量组分别以12.5、25、50μmol/L RPDPB干预,对照组只加DMSO不加药,48 h后采用RT-PCR法检测细胞人乳头瘤病毒18 E6(HPV18 E6)、人乳头瘤病毒18 E7(HPV18 E7)、WNT2B、β-catenin mRNA和miR-145 RNA。取对数生长期Hela细胞,将细胞分为实验组、对照组,实验组又分为不同剂量组,不同剂量组分别以12.5、25、50μmol/L RPDPB干预,对照组只加DMSO不加药,48 h后采用Western blot法检测细胞WNT2B、β-catenin蛋白。结果与对照组比较,实验组细胞增殖抑制率增加,且呈时间和剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率增加,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组HPV18 E6 mRNA、HPV18 E7 mRNA、WNT2B mRNA、β-catenin mRNA相对表达量降低,miR-145 RNA相对表达量升高,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。与对照组比较,实验组WNT2B、β-catenin蛋白相对表达量降低,且呈剂量依赖性(P均<0.05)。结论RPDPB可抑制宫颈癌Hela细胞增殖,并诱导细胞凋亡,呈时间和剂量依懒性,作用机制可能是其通过下调HPVE6/E7 mRNA表达,导致miR-145 RNA表达上调,进而抑制下游WNT2B/β-catenin通路中WNT2B、β-catenin mRNA和蛋白表达。

循环微小RNA-185在骨肉瘤中的表达及临床意义

目的观察微小RNA(miRNA,miR)-185在骨肉瘤患者中的表达,探讨其在骨肉瘤诊断及预后中的价值。方法采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测54对骨肉瘤患者和健康对照者(性别和年龄匹配)的miR-185表达。根据miR-185的中位数(2.381),将所有患者分为两组:高miR-185表达组(21)和低miR-185表达组(33)。然后分析miR-185表达与患者临床病理因素的相关性。血清样本在郑州大学第一附属医院2012年1月1日至2014年12月份从接受手术但未接受化学疗法或放射疗法的患者中收集,并分析miR-185表达与骨肉瘤患者的临床病理特征和总体生存率的关系。使用Manne WhitneyU检验比较骨肉瘤患者和正常对照组血清miR-185水平的差异。对数秩检验和Kaplan-Meier方法评估骨肉瘤患者的总体生存率。采用Cox回归和多因素分析评估预后价值。结果与正常对照组比较,骨肉瘤患者血清中的miR-185表达显著降低(U=373.000,P<0.05),差异有统计学意义。miR-185的低表达与较大的肿瘤体积(直径<5 cm比直径≥5 cm的miR-185:3.100±0.359比1.806±0.226,P<0.01),较高的TNM分期(一、二期比三、四期的miR-185:2.986±1.562比1.566±1.305,P<0.01)和远处转移(未转移比转移的miR-185:3.014±1.660比1.590±1.148,P<0.01)密切相关,差异有统计学意义。Kaplan-Meier曲线生存分析和对数秩检验显示,miR-185的低表达与骨肉瘤患者的总生存率降低有关。此外,多变量分析表明,miR-185表达降低是骨肉瘤患者总体生存的独立预后生物标志物(P<0.01),差异有统计学意义。结论血清miR-185可作为一种肿瘤抑制因子,有助于骨肉瘤患者的诊断、预后。

miR-543靶向TCF7L2调控BMSCs成脂分化的实验研究

目的探讨微小RNA-543(miR-543)靶向调控转录因子7类似物2(TCF7L2)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成脂分化的影响。方法分离并鉴定大鼠BMSCs,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测BMSCs成脂分化诱导过程中miR-543的表达变化;体外培养BMSCs细胞,对BMSCs细胞进行干预,过表达miR-543、抑制TCF7L2表达或同时过表达miR-543与TCF7L2,使用成脂分化诱导培养基培养,油红O染色检测BMSCs成脂分化;免疫印迹法检测BMSCs细胞TCF7L2、脂肪细胞蛋白2(aP2)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-543与TCF7L2的靶向关系。结果成功分离大鼠BMSCs;BMSCs成脂分化诱导处理1、2、3、4、5 d后miR-543表达水平降低;双荧光素酶报告基因实验证实miR-543与TCF7L2存在靶向关系;过表达miR-543或抑制TCF7L2表达,BMSCs油红O染色后OD值、aP2、PPAR-γ、C/EBPα蛋白表达水平显著降低(P<0.05);过表达TCF7L2可部分逆转过表达miR-543对BMSCs细胞成脂分化的抑制作用(P<0.05)。结论miR-543在大鼠BMSCs细胞成脂分化过程中下调表达,过表达miR-543可通过靶向抑制TCF7L2表达而抑制BMSCs细胞成脂分化。

miR-6883-3p靶向CHD1L抑制肝癌细胞的恶性表型

目的:寻找可靶向调控恶性肿瘤相关染色质解旋因子CHD1L的miRNAs分子,确证该调控模式对肝癌细胞恶性表型的影响。方法:通过生物信息学分析预测并筛选可靶向结合CHD1L的miRNAs,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹分析(Western Blot)方法验证所筛选的miRNAs对肝癌细胞CHD1L表达的影响,明确可转录后调控CHD1L表达的关键miRNA分子;qRT-PCR检测肝癌组织中miRNAs和CHD1L的表达,并对其表达进行相关性分析;MTS、细胞划痕、Transwell迁移实验验证目标miRNA分子对肝癌细胞恶性表型的影响。结果:生物信息学分析结果显示miR-6883-3p可显著下调肝癌细胞CHD1L表达。双荧光素酶报告实验检测结果证明miR-6883-3p可直接靶向结合CHD1L 3'UTR端。临床肝癌组织样本qRT-PCR检测及统计学分析结果显示CHD1L高表达于肝癌组织,而miR-6883-3p则高表达于癌旁组织,二者表达呈负相关。miR-6883-3p模拟物(mimic)可明显抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移;而miR-6883-3p抑制剂(inhibitor)可显著促进肝癌细胞增殖、促进细胞迁移。与对照组(Mock)相比,miR-6883-3p mimic组肝癌细胞内ALB表达则随着CHD1L表达的下调而增加,HNF-4α及AFP随着CHD1L表达的下调而减少,反之亦然。结论:miR-6883-3p通过靶向调控CHD1L表达,抑制肝癌细胞的恶性表型。